Chủng virus Đời Thời gian
6h 12h 24h 36h 48h 60h 72h 96h PEDV/TN8/2016 P1 - - + ++ +++ ++++ B P2 - - ++ +++ ++++ ++++ B P3 - + ++ ++++ ++++ B P4 - ++ +++ ++++ B P5 - +++ ++++ B PEDV/HY3/2015 P1 - - - + ++ +++ ++++ B P2 - - + ++ +++ ++++ B P3 - - ++ +++ +++ ++++ B P4 - + ++ +++ ++++ B P5 - + +++ ++++ B
(-): chưa có bệnh tích tế bào; B:bệnh tích tế bào bong khỏi đáy chai (CPE đạt 90-100%) (+): xuất hiện bệnh tích tế bào khoảng 5-10%; (++): CPE khoảng 20-30% ; (+++): CPE khoảng 40-50%;
Với kết quả theo dõi khả năng thích ứng của hai chủng PEDV phân lập trên tế bào Vero cho thấy hai chủng PEDV này có khả năng thích nghi tốt trên tế bào. Cụ thể, khi cấy truyền liên tiếp trên Vero, sự thích nghi và gây bệnh của 2 chủng PEDV này tăng dần theo các đời cấy truyền. Ở đời cấy truyền P1-P2 sau phân lập thành công, sự thích nghi của các chủng virus còn chậm, bệnh tích tế bào chỉ có thể quan sát được trong khoảng 24 -36 giờ sau gây nhiễm đối với chủng PEDV/TN8/2016 và PEDV/HY3/2015. Số lượng đám bệnh tích tế bào ít, kích thước đám CPE nhỏ chỉ khoảng vài chục nhân tế bào và nằm rải rác khắp bề mặt chai nuôi cấy (hình 4.4A). Thời gian tế bào bị phá hủy bong khỏi bề mặt chai (CPE đạt 90-100%) cũng chậm hơn dao động trong khoảng 72-96 giờ sau gây nhiễm.
Hình 4. 4. Bệnh tích tế bào của PEDV qua các đời cấy truyền ở 24 giờ sau gây nhiễm P2 P5 P4 P3 A B D C
Tuy nhiên, ở các đời cấy truyền sau từ (P3-P5) diễn biến bệnh tích tế bào phá triển nhanh vượt bậc (hình 4.4B, 4.4C, 4.4D). Thời gian xuất hiện CPE có thể quan sát được chỉ khoảng 12 giờ sau gây nhiễm, kích thước và số lượng đám CPE cũng tăng lên rất nhiều lần, đám bệnh tích to chứa tới hàng trăm nhân tế bào. Từ thời điểm quan sát thấy CPE đến thời điểm tế bào bị phá hủy 90-100% và bong khỏi bề mặt chai nuôi cấy rút ngắn hơn rất nhiều dao động trong khoảng 36-60 giờ gây nhiễm. Đặc biệt, chủng PEDV/TN8/2016 có tính thích ứng trên tế bào tốt hơn hẳn so với chủng PEDV/HY3/2015. Thời gian xuất hiện cũng như mức độ gia tăng CPE của chủng này từ 12-36 giờ sau gây nhiễm (CPE đạt 90-100%). Trong khi đó chủng PEDV/HY3/2015 thời điểm xuất hiện và mức độ gia tăng CPE dao động trong khoảng 12-48 giờ sau gây nhiễm. Trong khi đó, nghiên cứu của Hofmann and Wyler (1988) về khả năng thích ứng và nhân lên trên tế bào của PEDV cho thấy. Ở đời phân lập đầu tiên CPE quan sát thấy ở 3-5 ngày sau gây nhiễm, thời gian tế bào phá hủy hoàn toàn sau 2 ngày tính từ khi quan sát thấy CPE. Sau 4 đời cấy truyền liên tiếp trên tế bào Vero, thời gian tế bào bị phá hủy hoàn toàn rút ngắn lại chỉ khoảng 96 giờ sau khi gây nhiễm virus. Cũng nghiên cứu này, kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Hoa và cs. (2018) cho thấy thời gian xuất hiện bệnh tích tế bào (CPE) của PEDV xuất hiện sớm khoảng 12-24 giờ và tế bào bị phá hủy hoàn toàn sau 48 giờ gây nhiễm tính từ đời P0. Ở các đời cấy truyền tiếp theo (P4) thời gian bệnh tích tế bào xuất hiện rất sớm 8-12 giờ và thời gian tế bào phá hủy hoàn toàn là 36 giờ gây nhiễm. Như vậy, với kết quả nghiên cứu cho thấy, hai chủng PEDV phân lập được có khả năng thích ứng và nhân lên trên môi trường tế bào Vero tương tự như các chủng PEDV phân lập được của Nguyễn Thị Hoa và cs. (2018) đã công bố. Điều này có thể do đặc điểm nổi bật của các chủng PEDV phân lập tại Việt Nam hoặc môi trường và điều kiện phân lập đã được tối ưu hơn (Nguyễn Thị Hoa và cs., 2018).
4.3.2. Hiệu giá 2 chủng virus PED phân lập
Qua 5 lần cấy truyền liên tiếp trên tế bào Vero từ đời P1-P5 hiệu giá hai
chủng virus tăng dần qua các đời cấy chuyển từ 102,25 TCID50/ml đời P1 lên
105,88 TCID50/ml đời P4 đối với chủng PEDV/HY3/2015, từ 103,0 TCID50/ml
Hình 4. 5. Biểu đồ biểu thị hiệu giá chủng PEDV phân lập qua các đời cấy truyền
P1: Đời cấy truyền thứ nhất; P2: Đời cấy truyền thứ 2; P3: Đời cấy truyền thứ 3; P4: Đời cấy truyền thứ 4; P5: Đời cấy truyền thứ 5
Với kết quả nghiên cứu biểu thị trên biểu đồ hình 4.5 cho thấy, kết quả xác định hiệu giá 2 chủng PEDV phân lập hoàn toàn phù hợp với nghiên cứu đã công bố trước đây của Chen et al. (2014) đã xác định hiệu giá PEDV qua 5 đời cấy truyền dao động từ 102,3 đến 105,2 TCID50/ml, và dao động từ 105,1 đến 108,2
TCID50/ml qua 30 đời cấy truyền (Lee et al., 2015). Với hiệu giá có được của 2
chủng virus phân lập cho thấy sự thích nghi của chúng trên dòng tế bào Vero tương đối tốt. Tuy nhiên, hiệu giá virus chưa được cao như mong muốn, để các chủng virus này có thể hướng tới nghiên cứu chế tạo vắc - xin phòng bệnh cho lợn cần phải tối ưu các điều kiện nuôi cấy nhằm đẩy hiệu giá virus lên cao ít nhất
khoảng 107 TCID50/ml. Có nhiều yếu tố ảnh hưởng tới hiệu giá virus như loại môi
trường sử dụng, nồng độ trypsin, liều gây nhiễm (MOI), pH hay thời gian thu virus thích hợp… Theo nghiên cứu của Hofmann and Wyler (1989) đã công bố trước đây cho thấy: nhiệt độ, pH môi trường tác động trực tiếp đến khả năng sống sót của virus. Virus hoàn toàn mất khả năng sao chép và nhân lên ở pH>9 và pH<4 dù ở bất cứ nhiệt độ nào. Như vậy, để giải quyết được các vấn đề hiệu giá virus cần nhiều thời gian, công sức, vật tư hóa chất. Trong khi đó thời gian thực hiện đề tài nghiên cứu có hạn, nên cá nhân tôi chỉ tiến hành xác định một số đặc tính sinh học
cơ bản của hai chủng virus phân lập. Các phần còn thiếu của đề tài xin để ngỏ cho các nhà nghiên cứu sau này.
4.3.3. Đường cong sinh trưởng của 2 chủng virus PED
Trong nghiên cứu này, ở đời cấy chuyển thứ 5 cả hai chủng PEDV phân lập
cho hiệu giá cao nhất lần lượt là 105.88 TCID50/ml và 106.25 TCID50/ml tương ứng
với PEDV/HY3/2015, PEDV/TN8/2016 được sử dụng để xác định đường cong sinh trưởng (hình 4.6).
Hình 4.6. Đường biểu diễn tốc độ sinh trưởng của hai chủng virus PED phân lập theo thời gian
Kết quả hình 4.6 cho thấy, hiệu giá virus (trong tế bào và ngoài môi trường) tăng dần theo thời gian. Có thể nhận thấy tốc độ sinh trưởng của hai chủng virus phân lập tương đối giống nhau và có thể chia làm 3 giai đoạn: giai đoạn thích nghi (0 - 12 giờ sau gây nhiễm), giai đoạn lũy thừa (12- 48 giờ sau gây nhiễm), giai đoạn suy vong (sau 48 giờ gây nhiễm). Từ kết quả xây dựng đường cong sinh trưởng của hai chủng virus phân lập cho thấy, hiệu giá virus thu được cao nhất trong khoảng 36 - 48 giờ sau gây nhiễm. Cụ thể chủng PEDV/TN8/2016 đạt
106.5 TCID50/ml ở 36 giờ sau gây nhiễm, chủng PEDV/HY3/2015 đạt 106.0
TCID50/ml sau 48 giờ nhiễm virus. Kết quả nghiên cứu quy luật sinh trưởng của
2 chủng PEDV phân lập tương tự như kết quả nghiên cứu của Hofmann and
giờ gây nhiễm tế bào. Nghiên cứu này cũng chỉ ra rằng trong khoảng 36- 48 giờ là thời điểm tốt nhất để thu hoạch virus sau gây nhiễm cho hiệu gía cao.
Ngoài ra, trong quá trình theo dõi thí nghiệm tại mỗi thời điểm trước thu hoạch chai gây nhiễm, bệnh tích tế bào đều được quan sát và ghi nhận đối với từng chủng virus. Kết quả theo dõi diễn biến bệnh tích tế bào (CPE) được tổng hợp như hình 4.7. 6h ĐCTB 72h 36h 48h 60h 24h 12h
Hình 4.7. Bệnh tích tế bào theo thời gian
Từ hình 4.7 cho thấy thấy rằng bệnh tích tế bào tiến triển nhanh, có thể quan sát được ở 12h sau gây nhiễm đối với cả hai chủng virus phân lập. Sau đó bệnh tích tế bào ngày tiến triển nhanh, lan rộng hơn ở các giờ nuôi cấy tiếp theo. Từ 36-48 giờ sau gây nhiễm bệnh tích tế bào đạt khoảng 80-95%, đến 60 giờ 100% tế bào bị phá hủy. Đến 72 giờ các tế bào bong khỏi đáy chai nuôi, không theo dõi ghi nhận được CPE thêm nữa. Trong khi đó, chai đối chứng tế bào phát triển bình thường. Đặc tính gây bệnh nhanh và mạnh của virus PED trên tế bào
có tương quan với độc lực của virus khi gây bệnh trên động vật hay không điều này cần được thử nghiệm trên bản động vật.
4.3.4. Kết quả xác định độc lực của 2 chủng PEDV
Để đánh giá độc lực của hai chủng virus PED phân lập được thực hiện gây bệnh thực nghiệm cho nhóm lợn con dưới 7 ngày tuổi như mô tả phần phương pháp nghiên cứu. Kết quả gây bệnh thực nghiệm cho nhóm lợn con đối với cả hai chủng virus PED phân lập được tổng hợp trong (bảng 4.6), (hình 4.8 và 4.9).
Bảng 4. 6. Kết quả theo dõi triệu chứng lâm sàng của lợn con sau khi uống PEDV với các liều khác nhau
Chủng virus
Liều gây nhiễm (TCID50/ml)
Triệu chứng lâm sàng của bệnh Ngày sau khi uống
D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 PEDV/HY3/2015 104 + ++ ++ C 103 - - + + + + + 102 - - - - - - - PEDV/TN8/2016 104 ++ ++ C 103 - + + + + + + 102 - - - - - - - Lợn đối chứng - - - - - - -
D: ngày sau nhiễm virus theo đườg uống; C: lợn bị chết; (-): lợn bình thường không bị tiêu chảy; (+): lợn bị tiêu chảy nhẹ, phân nhão; ++: lợn bị tiêu chảy nặng, phân nhiều nước
Kết quả nghiên cứu cho thấy, ở liều gây nhiễm 104 TCID50/ml cả hai
chủng virus PED phân lập đều gây các triệu chứng lâm sàng trên lợn thí nghiệm từ rất sớm. Sau khoảng 24 giờ nhiễm một số lợn xuất hiện các triệu chứng đặc trưng như bỏ ăn, ủ rũ, mệt mỏi và tiêu chảy giống như mô tả của
Stevenson et al., (2013). Trong khi đó tại Việt Nam (Nguyễn Tất Toàn và Đỗ
Tiến Duy, 2013) cũng đã có nghiên cứu khảo sát về các triệu chứng lâm sàng của bệnh PED đặc trưng bởi: 100% tiêu chảy phân lỏng, 90,33% ói mửa. Tuy nhiên, trong nghiên cứu này mức độ tiêu chảy quan sát thấy ở hai chủng
PEDV là khác nhau. Chủng PEDV/HY3/2015 gây tiêu chảy trên lợn ở mức nhẹ hơn, phân ở dạng sệt (hình 4.8B, 4.8C) và chỉ có 1/2 cá thể lợn bị mắc tiêu chảy. Trong khi đó chủng PEDV/TN8/2016 gây tiêu chảy nặng cho cả 2/2 lợn thí nghiệm, phân lỏng toàn nước (hình 4.8D). Ở những lợn bị tiêu chảy, mẫu phân được lấy và kiểm tra bằng kít test nhanh PEDV nhằm xác định sự nhân lên và bài thải của virus PED trong ruột qua phân cho kết quả dương tính rõ nét (hình 4.8E). Những ngày tiếp theo mức độ tiêu chảy trầm trọng hơn,
toàn bộ lợn thí nghiệm của 2 chủng PEDV phân lập ở nồng độ 104 TCID50/ml
bị mất nước, kiệt sức, hôn mê do rối loạn cân bằng điện giải và chết ở ngày thứ 3 và thứ 4 sau thử nghiệm. Đặc điểm chung là các xác chết gầy, lông xơ xác, mắt trũng sâu, phần hậu môn lông bết dính nước và phân. Ở một nghiên
cứu khác, Chang et al. (2018) đã sử dụng chủng PEDV-PT/P5 thuộc nhóm
G2b cho lợn con 7 ngày tuổi uống với liều 105TCID50/ml, thấy thời gian xuất
hiện các triệu chứng lâm sàng đầu tiên của bệnh tiêu chảy cấp khoảng 18 giờ sau khi uống. Với kết quả nghiên cứu này cho thấy rằng thời điểm khởi phát các triệu chứng lâm sàng của bệnh phụ thuộc vào liều gây nhiễm và độc lực của chủng virus.
Đối liều gây nhiễm 103 TCID50/ml các dấu hiệu lâm sàng của bệnh tiêu
chảy cấp xảy ra chậm hơn và không có cá thể lợn nào bị chết. Cụ thể, liều 103
TCID50/ml với cả hai chủng PEDV phân lập hiện tượng tiêu chảy muộn hơn,
chủng PEDV/HY3/2015 có 1 cá thể có triệu chứng nôn mửa, tiêu chảy nhẹ phân nhão và kéo dài trong suốt thời gian nghiên cứu, cá thể lợn còn lại chỉ nôn mửa nhẹ ở ngày thứ 4 sau đó bình phục trở lại ở các ngày tiếp theo và không có hiện
tượng tiêu chảy. Chủng PEDV/TN8/2016 ở liều 103TCID50/ml cả hai cá thể lợn
đều nôn mửa và tiêu chảy nhẹ ở ngày thứ 2 sau thử nghiệm và cũng kéo dài trong suốt thời gian thử nghiệm còn lại, không có cá thể nào bị chết hay tiến triển nặng hơn. Nguyên nhân có thể lý giải do hàm lượng virus chưa đủ lớn để gây ra bệnh tiêu chảy cấp ở dạng cấp tính. Đồng thời theo thời gian một lượng virus bị trung hòa bởi kháng thể chống lại PEDV được sinh ra ở lợn thí nghiệm. Trong báo cáo
trước đây của de Arriba et al. (2002) cho thấy phát hiện kháng thể PEDVcó trong
huyết thanh xung quanh 7 ngày sau nhiễm PEDV. Đặc biệt, đến liều nhiễm
102TCID50/ml, lợn thí nghiệm ở cả hai chủng PEDV phân lập đều không xuất
hiện bất cứ biểu hiện, triệu chứng lâm sàng nào của bệnh tiêu chảy cấp, lợn thí nghiệm hoàn toàn khỏe mạnh ăn uống tốt.
A B C
D E F
M (+) 1 2 3 5
Hình 4.8. Một số dấu hiệu lâm sàng ghi nhận được trên lợn thí nghiệm
A: lợn ủ rũ bỏ ăn, nằm một chỗ; B:lông xung quanh hậu môn bết dính do tiêu chảy; C: lợn gầy còm, cơ thể suy nhược nghiêm trọng đứng không vững do tiêu chảy mất nước; D: lợn bị chết do tiêu chảy nặng, E: kiểm tra nhanh PEDV trong mẫu phân lợn tiêu chảy bằng kit test nhanh; F: kiểm tra PEDV trong mẫu
phân bằng RT - PCR
Hình 4.9. Hình ảnh mổ khám kiểm tra bệnh tích đại thể ở lợn thí nghiệm sau khi gây nhiễm PEDV
Khi mổ khám kiểm tra bệnh tích đại thể, có thể quan sát được sự khác nhau rõ ràng giữa những lợn bị tiêu chảy chết với những lợn thử nghiệm còn sống và khỏe mạnh. Ở lợn thử nghiệm còn sống khỏe mạnh không bị tiêu chảy, khi mổ khám thấy ruột non bình thường, không có hiện tượng căng phồng (hình 4.9D). Với những lợn bị tiêu chảy nặng chết khi mổ khám quan sát thấy đặc điểm chung là hiện tượng dạ dày, ruột non căng phồng, thành ruột mỏng có thể nhìn xuyên qua do tế bào niêm mạc ruột bị teo (mũi tên, hình 4.9A), chứa sữa không tiêu và dịch. Ngoài ra, các đoạn ruột non còn quan sát thấy cục sữa vón không tiêu, ruột
xuất huyết (mũi tên, hình 4.9B và 4.9C) (Sun et al., 2012). Tổng hợp các kết quả
mổ khám kiểm tra bệnh tích đại thể và kết quả test nhanh PEDV trong mẫu phân lợn tiêu chảy kết hợp với kiểm tra bằng kỹ thuật RT –PCR xác nhận PEDV có mặt trong mẫu phân có thể khẳng định hai chủng virus PED phân lập có độc lực đối với lợn con dưới 7 ngày tuổi (giai đoạn mẫn cảm).
4.3.5. Kết quả phân tích giải trình tự gen S của 2 chủng PEDV
Cùng với 17 trình tự của gen S tham chiếu trên ngân hàng genebank, tiến hành so sánh phân tích xây dựng được cây phả hệ của hai chủng PEDV phân lập (hình 4.9). Kết quả phân tích xây dựng cây phả hệ dựa trên trình tự toàn bộ gene S cho thấy 2 chủng PEDV phân lập được thuộc nhóm G2b, có mối quan hệ di truyền gần gũi với các chủng PEDV thu thập được ở các ổ dịch PED ở Việt Nam gần đây và nằm cùng nhánh với chủng PEDV/USA/Minnesota 135/2015. Nhóm G2b chính là biến chủng gây ra đợt dịch tiêu chảy cấp nghiêm trọng ở Mỹ cuối năm 2013.
Hình 4.10. Mối quan hệ di truyền giữa chủng PEDV/TN8/2016 và chủng PEDV/HY3/2015 với các chủng tham chiếu khác
Kể từ cuối năm 2013, một biến chủng PEDV mới với tỉ lệ lây nhiễm cao xuất hiện ở Mỹ và nhanh chóng lan ra các nước châu Á khác như Hàn Quốc
(Stevenson, 2013, Lee, 2014, Vlasova et al., 2014). Các nghiên cứu về mặt di
truyền cho thấy, biến chủng mới này có mối quan hệ di truyền gần với một chủng
AH2012 thu thập tại Trung Quốc trong năm 2012 (Stevenson, 2013, Vlasova et
al., 2014). Kết quả phân tích mối quan hệ di truyền cho thấy, ở Việt Nam tồn tại