Để đảm bảo rằng hai chủng virus PEDV/TN8/2016 và PEDV/HY3/2015 sau phân lập có thể sử dụng cho các mục đích nghiên cứu khác nhau thì yếu tố vô trùng thuần khiết của chủng giống cần phải được kiểm soát . Kết quả theo dõi vô trùng của 2 chủng virus PED được trình bày như bảng 4.3.
Bảng 4.3. Kết quả kiểm tra tạp khuẩn và tạp nấm của 2 chủng PEDV
MT Ngày
Thạch máu Thioglycolat Nước thịt Trypticaza soy Thạch nấm O1 O2 O1 O2 O1 O2 O1 O2 O1 O2 1 - - - - - - - - - - 2 - - - - - - - - - - 3 - - - - - - - - - - 4 - - - - - - - - - - 5 - - - - - - - - - - 6 - - - - - - - - - - 7 - - - - - - - - - - … 14 - - Kết luận Đạt Đạt Đạt Đạt Đạt O1: ống thứ nhất, O2: ống thứ 2
Kết quả thu được từ bảng 4.3 cho thấy, sau 7-14 ngày theo dõi, tất cả các ống môi trường kiểm tra đều cho kết quả âm tính, không quan sát thấy sự phát triển của vi khuẩn và nấm trong các ống môi trường nuôi cấy. Với các kết quả
trình bày ở trên, 2 chủng virus phân lập đạt tiêu chuẩn vô trùng không tạp nhiễm vi khuẩn và nấm mốc. Đồng thời, hai chủng PEDV phân lập được kiểm tra thuần khiết với một số loại virus gây tiêu chảy trên lợn như TGEV, PDCoV, Rota virus với mục đích loại trừ khả năng chủng virus PED phân lập được tạp nhiễm các loại virus trên. Để thực hiện điều này, nghiên cứu sử dụng kỹ thuật RT-PCR để xác minh. Kết quả được tổng hợp trong bảng 4.4 và hình 4.3.
Bảng 4.4. Kết quả kiểm tra tạp nhiễm virus ngoại lai
Stt Chỉ tiêu kiểm tra Phương pháp
kiểm tra Kết quả
1 Porcine Epidemic Diarrhea virus (PEDV) RT - PCR Dương tính
2 Delta Coronavirus (PDCoV) RT - PCR Âm tính
3 Rota Virus RT - PCR Âm tính
4 Transmissible Gastro Enteritis Virus (TGEV) RT - PCR Âm tính
M: maker 100bp; (+): đối chứng dương; (-): Đối chứng âm; TN8: Chủng PEDV/TN8/2016; HY3: Chủng PEDV/HY3/2015
Hình 4. 3. Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra tạp nhiễm của 2 chủng PEDV phân lập với một số loại virus gây tiêu chảy trên lợn khác
Kết quả thu được từ hình 4.3 cho thấy khi sử dụng cặp mồi đặc hiệu khuếch đại đoạn gen S của PEDV, cả 2 mẫu kiểm tra cho băng DNA rõ nét, kích thước khoảng 651 bp phù hợp với kích thước cặp mồi sử dụng. Như vậy, có thể khẳng định chắc chắn trong dịch nuôi cấy kiểm tra có PEDV. Trong khi đó kết quả RT- PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu phát hiện TGEV, Rotavirus và Deltacoronavirus
(-) M (+) TN8 HY3
Rota virus: 309bp PDCoV: 493bp
M (+) TN8 HY3 M (+) TN8 HY3
M (+) TN8 HY3
TGEV: 859bp PEDV: 651bp
cho kết quả âm tính. Với các kết quả kiểm tra tạp nhiễm thu được cho thấy hai