Phần 4 Kết quả và thảo luận
4.2. Kết quả phân lập virus từ các mẫu bệnh phẩm trên tế bào vero
TẾ BÀO VERO
4.2.1. Kết quả phân lập PEDV
Nghiên cứu phân lập virus PED được thực hiện trên tế bàoVero trong môi trường DMEM có bổ sung 10µg trypsin như mô tả phần phương pháp nghiên cứu. Kết quả đã phân lập thành công 2 chủng PEDV (tỷ lệ thành công 9,0%) (Phụ lục 1 và Bảng 4.2). Tuy nhiên, bệnh tích gây ra bởi virus PED trên tế bào Vero chỉ được phát hiện ở đời cấy chuyển thứ 2 đối với chủng PEDV/TN8/2016 và đời cấy chuyển thứ 3 đối với chủng PEDV/HY3/2015. Kết quả nghiên cứu này,phù hợp với kết quả nghiên cứu trước đây của Hofmann and Wyler (1988) tác giả đã quan sát được CPE ngay ở lần cấy truyền đầu tiên trên cùng một tế bào và hiệu ứng bệnh tích đặc trưng rõ ở đời cấy chuyển thứ 5 (Hofmann and Wyler, 1988). Trong khi đó, một nghiên cứu khác đã có kết quả báo cáo cho thấy CPE đặc trưng được phát hiện ở lần cấy truyền thứ 2 và trở nên rõ ràng hơn với các
lần cấy truyền tiếp theo trên tế bào Vero (Kusanagi et al., 1992). Ngoài ra, nỗ lực
phân lập virus PED từ các mẫu bệnh phẩm khác đều không thành công. Sự không thành công với các mẫu bệnh phẩm khác có thể do sự thích nghi của virus PED lên tế bào Vero phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: độ tươi của mẫu, nồng độ virus trong mẫu, thành phần các chất chứa trong ruột non.
Bảng 4.2. Kết quả phân lập PEDV trên tế bào Vero Tỉnh Năm thu Tỉnh Năm thu thập mẫu Số lượng mẫu Kết quả phân lập
Số mẫu dương tính Số mẫu âm tính
Hưng Yên 2015 6 1 5 2016 3 0 3 2017 3 0 3 Thái Nguyên 2015 4 0 4 2016 4 1 3 2017 2 0 2 Tổng 22 2 20
Đặc biệt trong quá trình nghiên cứu phân lập virus PED, tôi nhận thấy một số yếu tố làm ảnh hưởng tới tỷ lệ (%) phân lập thành công PEDV như: quan sát thấy độc tính trên tế bào Vero của một số mẫu ruột và phân. Xuất hiện hiện tượng co hoặc teo nhỏ tế bào sau khi gây nhiễm và ủ 1 giờ, các tế bào này tiếp tục nuôi cấy sau 24 giờ gây nhiễm bị bong và chết, không thể làm giá thể cho virus xâm nhập vào và nhân lên, bệnh tích tế bào không xuất hiện.Nguyên nhân ban đầu có thể do thành phần các chất chứa có trong mẫu bệnh phẩmcó tính axit hoặc kiềm tác động lên màng tế bào, làm tổn thương màng tế bào gây chết tế bào hoặc làm mất thụ thể trên màng tế bào để virus có thể bám vào. Một yếu tố khác cũng ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng phân lập virus thành công chính là mật độ thảm tế bào Vero một lớp ban đầu sử dụng cho cấy truyền mù PEDV. Mật độ thảm tế bào ban đầu nên ở 90-100% che phủ đáy chai nuôi, do trong môi trường phân lập có bổ sung trypsin, một loại enzyme dùng để bóc tách các tế bào rời nhau. Khi mật độ tế bào ít (các tế bào non đang trong giai đoạn phát triển cầu nối giữa các tế bào còn lỏng lẻo dễ dàng bị cắt đứt bởi trypsin) dưới tác động của trypsin các tế bào co lại bong khỏi đáy chai trôi nổi trong môi trường làm cho PEDV mất khả năng nhân lên trong tế bào dẫn tới giảm tỷ lệ (%) phân lập thành công PEDV. Mặt khác nồng độ trypsin bổ sung trong môi trường phân lập hêt sức quan trọng quyết định đến sự thành bại của nghiên cứu. Khi nồng độ trypsin trong môi trường từ 15-20µg/ml các tế bào bị tách rời bong khỏi đáy chai. Tuy nhiên, nếu nồng độ trypsin nhỏ hơn 15µg/ml trong môi trường, các tế bào ổn
định không bị tách rời và có thể quan sát được bệnh tích. Điều này phù hợp với
nghiên cứu của María Elena Trujillo-Ortega1 et al. (2016).
Vấn đề sử dụng kỹ thuật RT – PCR để xác định sự có mặt của virus trong dịch nuôi cấy bằng cách khuếch đại một đoạn gen của PEDV cũng đã được báo
cáo ở một số nghiên cứu trước. Trước đó, Kim et al. (2001) đã sử dụng kỹ thuật
RT – PCR khuếch đại một đoạn gen S xác định sự có mặt của PEDV trong dịch
nuôi cấy. Trong khi đó tác giả Li et al. (2012) khuếch đại gen M để xác định sự
có mặt của PEDV trong môi trường nuôi cấy. Ở nghiên cứu này, kỹ thuật RT –
PCR được sử dụng để khuếch đại 1 đoạn gen S có kích thước 651 bp của Kim et
al. (2001) nhằm xác nhận sự có mặt của PEDV trong dịch nuôi cấy cho kết quả
dương tính với virus này. Điều này chứng minh quá trình phân lập virus PED trên tế bào Vero đã thành công (hình 4.2A1 và 4.2B1).
PED/TN8/2016 PED/HY3/2015 Đối chứng tế bào
A1 B1 C1 B A C M (+) TN8(-) M (+) TN8 (-) (-) M (+) HY3 A1 (-) M (+) HY3 B1
Hình 4. 2. Biểu hiện bệnh tích tế bào của 2 chủng PEDV phân lập được và kết quả giám định bằng kỹ thuật RT –PCR
M: maker 1kb; A, B: Bệnh tích virus chủng PEDV/TN8/2016 và PEDV/HY3/2015; C: đối chứng tế bào không nhiễm virus; A1, B1,C1: Kết quả giám định RT –PCR chủng phân lập PEDV/TN8/2016,
Trong quá trình phân lập, với mẫu PEDV phân lập thành công bệnh tích quan sát được trên tế bào Vero được đặc trưng bởi sự dung giải màng tế bào và hợp nhất tế bào thành từng đám không bào chỉ chứa nhân tế bào giống như mô tả của (Hofmann and Wyler, 1988). Đặc biệt, không quan sát thấy sự khác biệt về đặc điểm bệnh tích tế bào giữa hai chủng virus phân lập được.
4.2.2. Kết quả kiểm tra vô trùng và thuần khiết của hai chủng virus phân lập
Để đảm bảo rằng hai chủng virus PEDV/TN8/2016 và PEDV/HY3/2015 sau phân lập có thể sử dụng cho các mục đích nghiên cứu khác nhau thì yếu tố vô trùng thuần khiết của chủng giống cần phải được kiểm soát . Kết quả theo dõi vô trùng của 2 chủng virus PED được trình bày như bảng 4.3.
Bảng 4.3. Kết quả kiểm tra tạp khuẩn và tạp nấm của 2 chủng PEDV
MT Ngày
Thạch máu Thioglycolat Nước thịt Trypticaza soy Thạch nấm O1 O2 O1 O2 O1 O2 O1 O2 O1 O2 1 - - - - - - - - - - 2 - - - - - - - - - - 3 - - - - - - - - - - 4 - - - - - - - - - - 5 - - - - - - - - - - 6 - - - - - - - - - - 7 - - - - - - - - - - … 14 - - Kết luận Đạt Đạt Đạt Đạt Đạt O1: ống thứ nhất, O2: ống thứ 2
Kết quả thu được từ bảng 4.3 cho thấy, sau 7-14 ngày theo dõi, tất cả các ống môi trường kiểm tra đều cho kết quả âm tính, không quan sát thấy sự phát triển của vi khuẩn và nấm trong các ống môi trường nuôi cấy. Với các kết quả
trình bày ở trên, 2 chủng virus phân lập đạt tiêu chuẩn vô trùng không tạp nhiễm vi khuẩn và nấm mốc. Đồng thời, hai chủng PEDV phân lập được kiểm tra thuần khiết với một số loại virus gây tiêu chảy trên lợn như TGEV, PDCoV, Rota virus với mục đích loại trừ khả năng chủng virus PED phân lập được tạp nhiễm các loại virus trên. Để thực hiện điều này, nghiên cứu sử dụng kỹ thuật RT-PCR để xác minh. Kết quả được tổng hợp trong bảng 4.4 và hình 4.3.
Bảng 4.4. Kết quả kiểm tra tạp nhiễm virus ngoại lai
Stt Chỉ tiêu kiểm tra Phương pháp
kiểm tra Kết quả
1 Porcine Epidemic Diarrhea virus (PEDV) RT - PCR Dương tính
2 Delta Coronavirus (PDCoV) RT - PCR Âm tính
3 Rota Virus RT - PCR Âm tính
4 Transmissible Gastro Enteritis Virus (TGEV) RT - PCR Âm tính
M: maker 100bp; (+): đối chứng dương; (-): Đối chứng âm; TN8: Chủng PEDV/TN8/2016; HY3: Chủng PEDV/HY3/2015
Hình 4. 3. Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra tạp nhiễm của 2 chủng PEDV phân lập với một số loại virus gây tiêu chảy trên lợn khác
Kết quả thu được từ hình 4.3 cho thấy khi sử dụng cặp mồi đặc hiệu khuếch đại đoạn gen S của PEDV, cả 2 mẫu kiểm tra cho băng DNA rõ nét, kích thước khoảng 651 bp phù hợp với kích thước cặp mồi sử dụng. Như vậy, có thể khẳng định chắc chắn trong dịch nuôi cấy kiểm tra có PEDV. Trong khi đó kết quả RT- PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu phát hiện TGEV, Rotavirus và Deltacoronavirus
(-) M (+) TN8 HY3
Rota virus: 309bp PDCoV: 493bp
M (+) TN8 HY3 M (+) TN8 HY3
M (+) TN8 HY3
TGEV: 859bp PEDV: 651bp
cho kết quả âm tính. Với các kết quả kiểm tra tạp nhiễm thu được cho thấy hai