Phần 3 Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu
3.4. Phương pháp nghiên cứu
- Khảo sát tỷ lệ bò mắc bệnh viêm tử cung: Tiến hành kiểm tra tỷ lệ bò sữa bị viêm tử cung tại 03 xã thuộc huyện Vĩnh Tường tỉnh Vĩnh Phúc .
- Lấy mẫu dịch viêm tử cung bò: Tiến hành lấy mẫu dịch viêm tử cung bò trên đàn bò sữa được nuôi tại các nông hộ thuộc 03 xã thuộc huyện Vĩnh Tường tỉnh Vĩnh Phúc. Chuyển các mẫu sữa về phòng thí nghiệm của Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam.
- Xác định vi khuẩn gây bệnh viêm tử cung bò bằng phương pháp phân lập vi khuẩn: Vi khuẩn gây bệnh viêm tử cung được phân lập theo phương pháp thường qui (Nguyễn Như Thanh và cs., 2001). Nuôi cấy các dịch cần chẩn đoán vào các môi trường thông thường và môi trường đặc biệt để xác định các đặc tính nuôi cấy, đặc tính sinh vật, hoá học của từng loại vi khuẩn. Đối chứng là những mẫu dịch tử cung của bò khoẻ mạnh, bình thường trong cùng đàn.
Phương pháp pha dịch chiết nồng độ 100mg/ml: Lấy 1g cao cô toàn phần pha với 10ml Dimethyl sulfoxide (DMSO), dùng đũa thủy tinh khuấy tan hoàn toàn ta được dung dịch có nồng độ 100mg/ml.
Nuôi cấy vi khuẩn Staphylococus aureus. và Streptococus spp. trên môi trường rắn và lỏng: Vi khuẩn được cấy vạch trong môi trường LB đặc, trên đĩa petri ủ 370C/24 giờ, chọn khuẩn lạc đơn điển hình. Khuẩn lạc đơn được nuôi cấy trong bình tam giác với môi trường LB lỏng, ủ ở 370C, với tốc độ lắc 200 vòng/phút trong 12 - 14h; thu dịch khuẩn (mật độ vi khuẩn phải đạt 108 tế bào/ml là đạt chuẩn).
Xác định mật độ vi khuẩn:Mật độ vi khuẩn sau khi nuôi cấy trong môi trường LB lỏng được xác định theo phương pháp đo mật độ quang ở λ= 600nm.
+ Kiểm tra tác dụng diệt khuẩn của các dịch chiết bằng phương pháp kháng sinh đồ khuếch tán trên đĩa thạch của Kirby-Bauer.
đạt 108 tế bào/ml, lắc đều bình chứa vi khuẩn, dùng pipetman hút 100µl canh khuẩn nhỏ vào giữa đĩa thạch, dùng que thủy tinh tráng đều cho đến khi mặt thạch khô. Sau 15 phút đục lỗ trên mặt thạch với đường kính 6mm/lỗ, đục cách nhau khoảng 30mm. Mỗi lỗ thạch, nhỏ 100µl dịch chiết, đặt đĩa vào tủ ấm ở 370C/24 giờ đọc kết quả bằng cách đo đường kính vòng vô khuẩn, rồi tính số bình quân.
Phương pháp pha loãng các nồng động cao: Chuẩn bị sẵn 10 ống nghiệm sạch, vô trùng, cho vào mỗi ống 5 ml DMSO, đánh số thứ tự từ 1 đến 10. Ống nghiệm 1, được cho thêm 5ml dung dịch cao lỏng nồng độ 100mg/ml.Trộn đều dịch chiết trong ống nghiệm 1, sau đó hút 5 ml chuyển sang ống nghiệm 2, trộn đều; chuyển tiếp 5 ml từ ống nghiệm 2 sang ống nghiệm 3, trộn đều;… đến ống nghiệm thứ 10, trộn đều và bỏ đi 5 ml.
Phương pháp định tính xác định một số nhóm hợp chất có trong dịch chiết thực vật
Định tính saponin trong thực vật: Tính tạo bọt là tính chất đặc trưng của sapon n. Chúng tô dựa vào h ện tượng tạo bọt để định tính sự có mặt của Sapon n trong dịch ch ết.
- Quan sát hiện tượng tạo bọt: Cho vào ống nghiệm lớn 5 g ọt dịch ch ết ở mỗ loạ , thêm 5ml nước. Lắc mạnh trong 5 phút. Để yên và quan sát hiện tượng tạo bọt. Nếu bọt còn bền vững sau 15 phút thì sơ bộ kết luận thực vật có chứa saponin.
Định tính flavonoid
- Phản ứng với kiềm: Nhỏ một giọt dịch chiết lên giấy lọc. Hơ khô rồi để lên miệng lọ amoniac đặc đã được mở nút, sẽ thấy màu vàng của vết dịch chiết được tăng lên. Nhỏ một giọt khác làm chứng.
- Phản ứng với FeCl3: Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịch chiết. Thêm vài giọt dung dịch FeCl3 5%. Sẽ xuất hiện tủa xanh đen.
Định tính tanin
- Tác dụng với dung dịch FeCl3 5%: Lấy 2ml dịch lọc, thêm 2 giọt dung dịch FeCl3 5% sẽ thấy kết tủa xanh đen.
- Tác dụng với dung dịch gelatin 1%: Lấy 2ml dịch lọc, thêm 5 giọt dung dịch gelatin 1% sẽ xuất hiện tủa bông trắng.
Định tính alkaloid bằng thuốc thử chung
- Tác dụng với thuốc thử Mayer (100ml nước cất, 1.36g HgCl2, 5g KI): Lấy một phần dịch chiết cho vào ống nghiệm 1ml. Nhỏ vào từng ống nghiệm 2 - 3 giọt thuốc thử Mayer, nếu có alkaloid sẽ cho tủa màu từ trắng đến vàng.
- Tác dụng với thuốc thử Bouchardat (100ml nước, 2.5g I2, 5g KI): Lấy một phần dịch chiết cho vào ống nghiệm 1ml. Nhỏ vào từng ống nghiệm 2 - 3 giọt thuốc thử Bouchardat, nếu có alkaloid sẽ cho tủa nâu đến đỏ nâu.
Định tính carotenoid: Thêm vào dịch chiết vài giọt H2SO4 đậm đặc. Nếu có carotenoid, dung dịch có màu xanh dương.
Định tính polyphenol: Cho vào mỗi ống nghiệm 1 mẫu cao khô mỗi loại dịch chiết, thêm 2ml nước cất và hòa tan đều. Nhỏ vào mỗi ống 1ml FeCl3 2%, lắc đều. Dung dịch chuyển sang màu xanh đen chứng tỏ có Polyphenol.
Định tính đường khử: Cho vào mỗi ống nghiệm một ít cao khô mỗi loại dịch chiết. Cho 2 ml nước cất vào mỗi ống, hòa tan, lắc đều. Nhỏ 2 - 3 giọt thuốc thử Fehling vào mỗi ống, nếu có kết tủa đỏ gạch chứng tỏ có đường khử.
Định tính chất nhầy: Tác dụng với chì acetat 10%: lấy 2ml dịch lọc, thêm 2 giọt chì acetat 10% sẽ xuất hiện tủa bông.
Định tính coumarin : Dựa vào độ tan khác nhau khi đóng và mở vòng
lacton: cho vào ống nghiệm mỗi ống 1 - 2 ml dịch chiết. Ống thứ nhất cho thêm 0.5 ml NaOH 10%, đun cách thủy cả 2 ống (ống có coumarin thường có màu vàng xuất hiện). Để nguội, thêm vào mỗi ống 4ml nước cất. Nếu ống 1 đục hơn ống 2 nhưng sau đó acid hóa mà độ đục hoặc kết tủa như ống 2 thì sơ bộ xác định có coumarin.
Phương pháp đánh giá khả năng kháng khuẩn in vitro của nano bạc
đối với vi khuẩn
Nồng độ dung dịch nano đem cấy trộn là 100 ppm (nồng độ gốc).
Pha loãng nano theo dãy pha loãng như đã nêu ở trên (sử dụng nước đề ion để pha loãng nano), bổ sung vào mỗi ống 10 µl dịch khuẩn. Sau đó, cấy chang trên bề mặt đĩa thạch để quan sát khả năng ức chế vi khuẩn.
Nuôi tủ ấm 370/24 giờ, lấy ra đọc kết quả: Xác định nồng độ nano pha loãng thấp nhất còn có khả năng ức chế vi khuẩn.
Phương pháp đánh giá khả năng kháng khuẩn in vitro của dịch chiết thực vật khi phối trộn với nano bạc
Phối trộn dịch chiết với nano bạc: Hút 5ml dịch chiết thực vật được tách chiết, ở các nồng độ pha loãng khác nhau cho vào các ống nghiệm, tiếp tục hút 5ml nano bạc ở nồng độ ức chế tối thiểu cho lần lượt vào các ống nghiệm này, lắc đều. Hút 100µl hỗn hợp dịch chiết thực vật và nano bạc nhỏ lên các lỗ thạch trong đĩa môi trường đã được chang khuẩn. Sau đó nuôi ủ ở điều kiện 370C, sau 24h lấy ra đo đường kính vòng vô khuẩn, đánh giá khả năng kháng khuẩn của hỗn hợp dịch chiết thực vật và nano bạc dựa vào đường kính vòng vô khuẩn.
Phương pháp điều trị thử nghiệm: Sử dụng phác đồ điều trị như sau:
* Phác đồ 1: Thụt rửa tử cung bằng dung dịch Rivanol 0,1% ngày 1 lần, sau khi thụt rửa kích thích cho dung dịch thụt rửa chảy hết ra ngoài, dùng Norfloxacin 5mg/kg thể trọng pha với 100ml nước cất bơm vào tử cung; kết hợp điều trị toàn thân bằng ADE, B.complex. Liệu trình điều trị không quá 5 ngày.
* Phác đồ 2: Thụt rửa tử cung bằng dung dịch Rivanol 0,1% ngày 1 lần, sau khi thụt rửa kích thích cho dung dịch thụt rửa chảy hết ra ngoài, dùng cao khô dịch chiết Sài đất 10 mg/kg thể trọng pha với 100ml nước cất bơm vào tử cung; kết hợp điều trị toàn thân bằng ADE, B.complex. Liệu trình điều trị không quá 5 ngày.
* Phác đồ 3: Thụt rửa tử cung bằng dung dịch Rivanol 0,1% ngày 1 lần, sau khi thụt rửa kích thích cho dung dịch thụt rửa chảy hết ra ngoài, dùng cao khô dịch chiết Sài đất 10 mg/kg thể trọng pha với 100ml nước cất và bổ sung nano bạc đến nồng độ 25 ppm bơm vào tử cung; kết hợp điều trị toàn thân bằng ADE, B.complex. Liệu trình điều trị không quá 5 ngày.
Phương pháp xử lý số liệu
Các thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên và được lặp lại 3 lần. Số liệu thu được xử lý thống kê sinh học bằng phần mềm Excel 2007.