Phần 4 Kết quả và thảo luận
4.4.Đánh giá khả năng ức chế vi khuẩn in vitro của cao dịch chiết trong các dung
DỊCH CHIẾT TRONG CÁC DUNG MÔI KHÁC NHAU VỚI VI KHUẨN PHÂN LẬP TỪ DỊCH VIÊM TỬ CUNG BÒ
Sau khi thu được cao khô dịch chiết ở thí nghiệm trên, chúng tôi tiến hành pha cao dịch chiết bằng dung môi DMSO đạt nồng độ 100mg/ml để tiến hành thí nghiệm, đánh giá khả năng diệt khuẩn in vitro của các loại dịch chiết trong các dung môi khác nhau đối với các vi khuẩn phân lập.
4.4.1. Khả năng ức chế in vitro của cao khô dịch chiết sử dụng các dung môi
khác nhau trên vi khuẩn Staphylococcus spp phân lập từ dịch viêm tử cung bò
Ampicillin là kháng sinh thuộc nhóm β-Lactamin, có phổ rất rộng, tác dụng cả với vi khuẩn gram (+), gram (-), tác dụng mạnh trên tụ cầu, liên cầu và cả trực khuẩn gây mủ xanh. Nên chúng tôi lựa chọn giấy tẩm kháng sinh Ampicillin (10µg) làm đối chứng cho thí nghiệm đối với vi khuẩn Staphylococcus spp.
Bảng 4.6. Khả năng ức chế in vitro của cao khô dịch chiết Sài đất trong các dung môi khác nhau với vi khuẩn Staphylococcus spp.
STT Dung môi Đường kính vòng vô khuẩn (mm) D1 D2 D3 Dtb ± s 1 Đ/c DMSO 0 0 0 0 2 Ampicillin 23 23 22 22,67 ± 0,67 3 Nước cất 0 0 0 0 4 Acid acetic 5% 16 16 17 16,33± 0,67 Ethanol 35% 22 23 23 22,67 ± 0,67 5 Eethanol 70% 25 24 23 24,00 ± 1,00 6 Aceton nitril 100% 22 21 20 21,00 ± 1,00
Ghi chú: D1, D2, D3: Đường kính vòng vô khuẩn của các lần thử 1,2,3; Dtb: Đường kính vòng vô khuẩn trung bình; s: Độ lệch thực nghiệm chuẩn có hiệu chỉnh.
Kết quả thử nghiệm trên vi khuẩn Staphylococcus spp. được trình bày ở bảng 4.6 cho thấy, có 4/5 loại cao khô dịch chiết Sài đất có hoạt tính ức chế vi khuẩn in vitro với đường kính vòng vô khuẩn biến đổi từ 16,33 mm (dung môi acid acetic 5%) đến 24,00 mm (dung môi ethanol 70%). Cao khô dịch chiết sử dụng dung môi nước cất không có khả năng ức chế vi khuẩn in vitro với đường kính vòng vô khuẩn 0 mm. Cao khô dịch chiết sử dụng dung môi ethanol và aceton nitril đều cho đường kính vòng vô khuẩn > 20mm đều đạt độ mẫn cảm cao đối với vi khuẩn. Các loại cao khô dịch chiết này đều có độ mẫn cảm cao hơn hoặc bằng khả năng ức chế vi khuẩn in vitro của kháng sinh ampicillin. Cao khô dịch chiết sử dụng dung môi nước cất và acid acetic 5% có khả năng ức chế vi khuẩn thấp hơn 3 cao khô dịch chiết sử dụng dung môi khác (ethanol 35%, ethanol 70% và aceton nitril) phù hợp với kết quả nghiên cứu định tính xác định một số nhóm hoạt chất hòa tan trong cao khô dịch chiết lá Sài đất bằng phương pháp hóa học. Cao khô dịch chiết sử dụng dung môi ethanol và aceton nitril cho phản ứng dương tính với 9/10 và 8/10 phản ứng định tính trong khi đó cao khô sử
dụng dung môi nước và acid acetic chỉ cho phản ứng dương tính với 5/10 và 6/10 phản ứng định tính. Kết quả đánh giá khả năng ức chế vi khuẩn được thể hiện cụ thể ở hình 4.5
Kết quả nghiên cứu của chúng tôi khá phù hợp với nghiên cứu của Phạm Thị Dung (2015) khi đánh giá khả năng ức chế vi khuẩn in vitro của cao khô dịch chiết lá cây Đơn đỏ trong các dung môi khác nhau đối với vi khuẩn Staphylococcus aureus phân lập từ dịch viêm tử cung chó. Kết quả nghiên cứu này cho thấy ở nồng độ100 mg/ml cao khô dịch chiết cho kết quả đường kính vòng vô khuẩn khác nhau phụ thuộc vào dung môi sử dụng (DC Chloroform (17,67 ± 1,00 mm); DC Aceton (21,67 ± 1,00 mm), DC Ethanol (23,33 ± 1,00 mm), DC Methanol (24,00 ± 1,73 mm), DC Acetic acid (37,33 ± 1,00 mm)). Cao khô dịch chiết sử dụng dung môi nước không cho khả năng ức chế vi khuẩn in vitro. Tuy nhiên trong nghiên cứu này lại cho thấy dịch chiết sử dụng dung môi acid acetic cho khả năng ức chế vi khuẩn in vitro tốt nhất.
Hình 4.5. Khả năng ức chế in vitro của cao khô dịch chiết sử dụng các dung
môi khác nhau với vi khuẩn Staphylococcus spp.
Theo nghiên cứu của Khúc Huy Hoàng (2015) cho thấy 5 loại cao khô dịch chiết lá cây Huyền diệp sử dụng các loại dung môi khác nhau đều cho hoạt tính ức chế vi khuẩn Staphylococcus aureus phân lập từ sữa bò bị viêm vú . Với nồng độ dịch chiết 100mg/ml cho kết quả đường kính vòng vô khuẩn như sau: DC nước (20,67 ± 1,15mm); DC Ethanol (22,67 ± 1,53 mm), DC Cloroform (24,00 ± 1.00mm), DC Ether dầu (20,67 ± 1,15 mm), DC Ethyl axetate (21,00
± 1,00 mm). Trong đó, dịch chiết Chloroform thể hiện hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất, với đường kính vòng vô khuẩn là 24,00 ± 1,00mm; cao hơn kháng sinh chuẩn Ampicillin (50mg/ml), với đường kính vòng vô khuẩn là 21,67 ± 1,53 mm. DC Ethanol cũng cho kết quả cao hơn kháng sinh chuẩn là 22,67 ± 1,53mm. Các dịch chiết còn lại cho kết quả thấp hơn kháng sinh Ampicillin, nhưng thấp hơn không nhiều.
4.4.2. Khả năng ức chế in vitro của cao khô dịch chiết sử dụng các dung môi
khác nhau trên vi khuẩn Streptococcus spp phân lập từ dịch viêm tử cung bò
Bằng phương pháp khuếch tán trên thạch, 5 loại dịch chiết (1:10) có nồng độ 100mg/ml được thử hoạt tính kháng khuẩn trên vi khuẩn Streptococcus spp. Đối chứng so sánh với kháng sinh chuẩn là Ampicillin (50mg/ml). Kết quả kháng sinh đồ của 3 lần lặp lại được trình bày ở bảng 4.7.
Bảng 4.7. Khả năng ức chế in vitro của cao khô dịch chiết Sài đất trong các dung môi khác nhau với vi khuẩn Streptococcus spp.
STT Dung môi Đường kính vòng vô khuẩn (mm) D1 D2 D3 Dtb ± s 1 Đ/c DMSO 0 0 0 0 2 Ampicillin 23 23 24 23,33 ± 0,67 3 Nước cất 0 0 0 0 4 Acid acetic 5% 18 16 17 17,00± 1,00 Ethanol 35% 20 23 23 22,00 ± 2,00 5 Eethanol 70% 25 24 24 24,33 ± 0,67 6 Aceton nitril 100% 22 22 21 21,67 ± 0,67
Ghi chú: D1, D2, D3: Đường kính vòng vô khuẩn của các lần thử 1,2,3
Dtb: Đường kính vòng vô khuẩn trung bình.
s: Độ lệch thực nghiệm chuẩn có hiệu chỉnh.
Kết quả thử nghiệm trên vi khuẩn Streptococcus spp. được trình bày ở bảng 4.7. cho thấy, có 4/5 loại cao khô dịch chiết Sài đất có hoạt tính ức chế vi khuẩn in vitro với đường kính vòng vô khuẩn biến đổi từ 17,00 mm (dung môi acid acetic 5%) đến 24,33 mm (dung môi ethanol 70%). Cao khô dịch chiết sử dụng dung môi nước cất không có khả năng ức chế vi khuẩn in vitro với đường kính vòng vô khuẩn 0 mm. Cao khô dịch chiết sử dụng dung môi ethanol và aceton nitril đều cho đường kính vòng vô khuẩn > 20mm đều đạt độ mẫn cảm cao đối với vi khuẩn. Các loại cao khô dịch chiết này đều có độ mẫn cảm cao hơn
hoặc bằng khả năng ức chế vi khuẩn in vitro của kháng sinh ampicillin. Cao khô dịch chiết sử dụng dung môi nước cất và acid acetic 5% có khả năng ức chế vi khuẩn thấp hơn 3 cao khô dịch chiết sử dụng dung môi khác (ethanol 35%, ethanol 70% và aceton nitril) phù hợp với kết quả nghiên cứu định tính xác định một số nhóm hoạt chất hòa tan trong cao khô dịch chiết lá Sài đất bằng phương pháp hóa học. Cao khô dịch chiết sử dụng dung môi ethanol và aceton nitril cho phản ứng dương tính với 9/10 và 8/10 phản ứng định tính trong khi đó cao khô sử dụng dung môi nước và acid acetic chi cho phản ứng dương tính với 5/10 và 6/10 phản ứng định tính. Kết quả đánh giá khả năng ức chế vi khuẩn được thể hiện cụ thể ở hình 4.6.
Hình 4.6. Khả năng ức chế in vitro của cao khô dịch chiết sử dụng các dung
môi khác nhau với vi khuẩn Streptococcus spp
Kết quả nghiên cứu của chúng tôi khá phù hợp với nghiên cứu của Khúc Huy Hoàng (2015) khi đánh giá khả năng ức chế vi khuẩn in vitro của cao khô dịch chiết lá cây Đơn đỏ trong các dung môi khác nhau đối với vi khuẩn Streptococcus spp phân lập từ dịch viêm vú bò. Kết quả nghiên cứu này cho thấy ở nồng độ100 mg/ml cao khô dịch chiết cho kết quả đường kính vòng vô khuẩn khác nhau phụ thuộc vào dung môi sử dụng (DC Cloroform (24,67 ± 0,58 mm); DC Ethanol (22,00 ± 1,00 mm); DC Ether dầu (19,33 ± 1,53 mm); DC Ethyl axetate (19,67 ± 1,53 mm); DC nước (17,67 ± 0,58 mm)). Tuy nhiên cao khô dịch chiết sử dụng dung môi nước trong nghiên cứu này cho khả năng ức chế vi khuẩn in vitro.
Staphylococcus chịu ảnh hưởng của các dịch chiết. Vậy với vi khuẩn Gram (+) thì cao dịch chiết sử dụng dung môi ethanol và aceton nitril cho kết quả rất cao, cao hơn cả kháng sinh thử nghiệm. Trong tương lai có thể thay thế kháng sinh tổng hợp bằng kháng sinh thực vật mà kết quả phòng trị không thay đổi lại còn hạn chế nguy cơ tạo dòng vi khuẩn kháng thuốc. Trong 02 loại cao khô dịch chiết sử dụng dung môi ethanol, thì cao khô dịch chiết sử dụng dung môi ethanol 70% có khả năng ức chế tốt nhất đối với cả hai chủng vi khuẩn nghiên cứu, do đó chúng tôi lựa chọn cao khô dịch chiết Sài đất sử dụng dung môi ethanol 70% và aceton nitril 100% để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo.
4.4.3. Khả năng ức chế in vitro của cao khô dịch chiết sử dụng dung môi ethanol 70% trên vi khuẩn phân lập từ dịch viêm tử cung bò khi pha loãng ethanol 70% trên vi khuẩn phân lập từ dịch viêm tử cung bò khi pha loãng
Nhằm nghiên cứu sâu hơn về khả năng ức chế vi khuẩn in vitro của dịch chiết dược liệu Sài đất trong dung môi ethanol 70% và aceton nitril 100%, cũng như tìm ra nồng độ thấp nhất khi pha loãng có khả năng ức chế vi in vitro đối với 02 chủng vi khuẩn phân lập cũng như kiểm chứng để lựa chọn liều điều trị thử nghiệm, chúng tôi tiến hành thí nghiệm pha loãng dịch chiết để kiểm tra khả năng diệt khuẩn in vitro.
Bằng phương pháp pha loãng liên tiếp cao dịch chiết Sài đất sử dụng dung môi ethanol 70% và aceton nitril ở nồng độ 100mg/ml với hệ số pha loãng ½, sau đó, tiến hành kiểm tra khả năng diệt khuẩn in vitro trên môi trường thạch.
Thông qua sự có hay không xuất hiện của vòng vô khuẩn, có thể xác định nồng độ tối thiểu thấp nhất của dịch chiết dược liệu Sài đất có thể ức chế sự phát triển của vi khuẩn, kết quả được thể hiện ở bảng 4.8.
Kỹ thuật này nhằm mục đích xác định chính xác nồng độ nhỏ nhất của dịch chiết lá cây Sài Đất có tác dụng ức chế sự phát triển của một chủng vi khuẩn trong môi trường nuôi cấy (phương pháp định lượng). Dựa theo nguyên lý nồng độ kháng sinh (dịch chiết) tăng dần trong môi trường nuôi cấy, khi đạt đến một nồng độ nhất định nó sẽ ức chế được sự phát triển của vi khuẩn và bằng mắt thường đã có thể xác định được điều này thông qua quan sát sự xuất hiện có hay không có vòng vô khuẩn.
Bảng 4.8. Khả năng ức chế vi khuẩn khi pha loãng cao khô dịch chiết dược liệu Sài đất
khuẩn 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024 Nồng độ cao khô dịch chiết lá cây Sài đất, mg/ml
50 25 12,50 6,25 3,13 1,56 0,78 0,39 0,20 0,10
Cao khô dịch chiết sử dung dung môi aceton nitril 100%
Sta. + + + + + + + - - -
Strep. + + + + + + + + - -
Cao khô dịch chiết sử dung dung môi ethanol 70%
Sta. + + + + + + + + + -
Strep. + + + + + + + + - -
Ghi chú: (+) : Có đường kính vòng vô khuẩn (-) : Không có đường kính vòng vô khuẩn.
Kết quả nghiên cứu cho thấy, cao khô dịch chiết sử dụng dung môi aceton nitril 100% (100mg/ml) pha loãng lớn nhất 256 lần với nồng độ tương ứng là 0,391 mg/ml vẫn còn khả năng ức chế in vitro vi khuẩn Streptococcus spp. Đối với vi khuẩn Staphylococcus nồng độ tối thiểu khi pha loãng vẫn còn quan sát thấy vòng vô khuẩn là 0,78 mg/ml tương đương với hệ số pha loãng 128 lần.
Cao khô dịch chiết sử dụng dung môi ethanol 70%(100mg/ml) pha loãng lớn nhất 512 lần với nồng độ tương ứng là 0,20 mg/ml vẫn còn khả năng ức chế in vitro vi khuẩn Streptococcus spp. Đối với vi khuẩn Staphylococcus spp. nồng độ tối thiểu khi pha loãng vẫn còn quan sát thấy vòng vô khuẩn là 0,78 mg/ml tương đương với hệ số pha loãng 256 lần.
Khi so sánh với kết quả nghiên cứu của Phạm Thị Dung (2015) cho thấy, khả năng ức chế vi khuẩn in vitro của cao khô dịch chiết Sài đất tốt hơn so với cao khô dịch chiết Đơn đỏ. Trong nghiên này nồng độ nhỏ nhất khi pha loãng cao khô dịch chiết Đơn đỏ vẫn còn khả năng ức chế vi khuẩn in vitro là 1,56 mg/ml đối với vi khuẩn Staphylococcus spp.
Khả năng ức chế vi khuẩn in vitro của cao khô dịch chiết Sài đất khi pha loãng tương đương với cao khô dịch chiết Huyền diệp sử dụng dung môi ethanol 70%. Theo nghiên cứu của Khúc Huy Hoàng (2015) cho thấy nồng độ nhỏ nhất cao khô dịch chiết Huyền diệp có tác dụng ức chế vi khuẩn Streptococcus spp. và Staphylococcus spp. gây viêm vú bò là 0,02 mg/ml.
4.5. ĐÁNH GİÁ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ Vİ KHUẨN STREPTOCOCCUS
SPP. VÀ STAPHYLOCOCCUS SPP. CỦA NANO BẠC
Từ lâu loài người đã biết đến tác dụng sát khuẩn mạnh của bạc, những chén bát, thìa nĩa, nồi niêu của người La Mã cổ, của các vua chúa phong kiến,.. đã chứng minh điều đó. Trong chiến tranh thế giới thứ nhất, người ta thậm chí còn sử dụng các sản phẩm từ bạc để điều trị nhiễm trùng trước khi thuốc kháng sinh ra đời. Tuy nhiên, tác dụng này của bạc không được ứng dụng rộng rãi do giá thành cao. Những năm gần đây, công nghệ nano ra đời, con người đã chế tạo được bạc ở kích thước nano, và ứng dụng của bạc cũng được đưa lên một tầm cao mới. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng khi ở kích thước nano (từ 1 đến 100nm), hoạt tính sát khuẩn của bạc tăng lên khoảng 50000 lần so với bạc dạng khối, Điều này sẽ giúp cho khối lượng bạc sử dụng trong các sản phẩm sẽ giảm rất mạnh, nên tỷ trọng của bạc trong giá thành trở nên không đáng kể. Nano bạc không chỉ được ứng dụng trong lĩnh vực y tế mà cả trong công nghệ thực phẩm và sản xuất hàng tiêu dùng bởi tác dụng kháng khuẩn của nó mà không gây ô nhiễm môi trường. Trong chăn nuôi, nano bạc cũng đã được đưa vào để phòng, điều trị và diệt các nguồn bệnh từ vi khuẩn, virus và bào tử nấm gây ra cho thủy sản. Tuy nhiên các nghiên cứu này còn hạn chế, đặc biệt là công tác phòng và trị bệnh cho gia súc, gia cầm, nhất là khi hiện tượng kháng thuốc diễn ra phổ biến.
Nhằm khẳng định khả năng diệt khuẩn in vitro cũng như ứng dụng Nano bạc trong phòng và trị bệnh cho vật nuôi nói chung và bệnh viêm tử cung bò nói riêng chúng tôi tiến hành thí nghiệm đánh giá khả năng diệt khuẩn in vitro của nano bạc đến vi khuẩn phân lập từ dịch viêm tử cung bò.
Bằng phương pháp trộn trực tiệp dịch khuẩn với dung dịch Nano bạc, sau đó cấy chang trên môi trường đặc, sau 24h quan sát và phân tích kết quả.
Khi sử dụng 50µl vi khuẩn +50µl dung dịch nano bạc ở nồng độ gốc 100 ppm trộn đều trước khi cấy chang trên bề mặt thạch cho thấy, sau 24h quan sát trên bề mặt thạch với cả 02 chủng vi khuẩn đều không thấy xuất hiện khuẩn lạc chứng tỏ khả năng diệt khuẩn in vitro của Nano bạc. Trong khi đó ở đĩa đối chứng khi sử dụng 50µl vi khuẩn +50µl nước cất đối với cả 02 chủng vi khuẩn đều thấy sau 24h đã thấy vi khuẩn mọc phủ đầy trên bề mặt thạch (Hình 4.7).
Để kiểm tra tác dụng diệt khuẩn in vitro của nano bạc, tiến hành pha loãng dung dịch Nano bạc để đánh giá tác dụng đối với các vi khuẩn thử nghiệm.
Kết quả thí nghiệm được thể hiện ở bảng 4.9.
Bảng 4.9. Kết quả khảo sát hoạt tính diệt khuẩn in vitro của dung dịch nano