Cách sử dụng truyền thống
Các tài liệu cho thấy rằng các bộ phận khác nhau của cây Sài đất đã được sử dụng như một loại thuốc dân gian cho các bệnh khác nhau như hiệu quả bảo vệ gan, thông mật, vàng da, tiêu chảy, đi văng, chứng đau nhức đầu, bạch hầu và chứng ho lâu ngày…. Trong nước sắc cây được sử dụng như một chất khai thông và được đề xuất trong xuất huyết tử cung và rong kinh. Các lá được coi là loại thuốc bổ, phục hồi chức năngvà hữu ích trong ho, chứng đau đầu, bệnh ngoài da và rụng tóc. Dịch ngâm, chiết của cây được đưa ra trong Đông dương để giảm
chứng chướng bụng. Các thuốc sắc của cây được sử dụng rộng rãi bởi các bộ lạc ở Kolli Hills của Namakkal, Tamilnadu, Ấn Độ, để giảm bớt sự căng thẳng về tinh thần và cũng để kích thích ngủ và ảnh hưởng đến thần kinh trung ương.
Cây này là chất làm se da, đắng, chát, sinh nhiệt, kháng viêm, chữa thương, nhãn khoa, cardiotonic, thuốc trừ giun sán, thuốc lợi tiểu, thuốc kích dục, bài tiết mồ hôi, giải nhiệt và kích thíc mọc tóc là hữu ích trong điều kiện làm mất hiệu lực của Kapha và Vata, viêm, chứng phù voi, đau tai, chứng đau đầu, vết thương, loét, chứng quáng gà, thị lực kém, to gan lách, chứng khó tiêu, giun sán, bịnh đái từng giọt, sốt, hói đầu và già của tóc. Cây Sài đất là rất đặc trưng cho viêm gan virus. Theo truyền thống, các quả, lá và thân cây được sử dụng trong sinh con và trong điều trị các vết cắn và đốt, sốt và nhiễm trùng. Các lá được sử dụng trong điều trị rối loạn chức năng thận, lạnh, vết thương và vô kinh.
Các nghiên cứu dược lý
Mặc dù rất nhiều điều tra dược lý đã được thực hiện trên các thành phần hóa học của cây hiện nay, tuy nhiên vẫn có thể khám phá, khai thác và sử dụng nhiều hơn. Dưới đây trình bày tóm tắt kết quả của những nghiên cứu dược lý.
Bảo vệ gan
Dịch chiết cồn cây Sài đất hoạt động chống lại sự có mặt của carbon tetrachloride gây hại cho gan trong cơ thể. Chiết xuất này cũng tăng dòng chảy của mật ở chuột cho thấy kích thich công suất bài tiết của gan. Các tác dụng bảo vệ gan của một loại thảo mộc thô Đài Loan, Hwang-hua-mih-Tsay (W. chinensis (Osbeck) Merr.) đã được báo cáo. Những quan sát huyết thanh đã được khẳng định bởi thi mô bệnh học. Một cuộc kiểm tra bằng kính hiển vi của gan cho thấy cải thiện rõ rệt trong nhóm nhận Sài đất. Nó tiếp tục khẳng định tác dụng bảo vệ gan của Sài đất, tất cả dược lý và các tác dụng mô bệnh học được so sánh với Bupleurum chinense DC (họ Umbellifera) - một loại thảo mộc chống tính độc hại gan. Từ đó kết luận rằng Sài đất có tác dụng nhất định đối với chấn thương gan, bảo vệ gan.
Chữa lành vết thương
Hiệu quả của dịch chiết xuất lá của Sài đất với dung môi là nước về chữa lành vết thương, trong mờ và liền vế khâu, được quan sát và tìm thấy là đáng kể. Hiệu quả chữa lành vết thương của dịch chiết cồn lá cây Sài đất được đánh giá trong cắt bỏ, rạch và vị trí bị bệnh ở các vết thương các mô hình. Chiết xuất cồn
của nó có hoạt tính làm lành vết thương đáng kể, trong đó đã được chứng minh bằng sự giảm xuống trong thời gian biểu mô, tăng trong tỷ lệ vết thương co.
Kháng ung thư
Các chiết xuất Methanol của Sài đất được đánh giá đối với hoạt động chống ung thư của nó chống lại Ehrlich Ascites Carcinoma (EAC) ở chuột bạch tạng Thụy Sĩ. Vào ngày thứ nhất, tiêm chiết xuất Sài đất ở liều 250 và 500 mg/kg trọng lượng cơ thể đã được dùng đường uống và tiếp tục trong 9 ngày liên tiếp. Các hoạt động chống ung thư của chiết xuất Methanol Sài đất được kiểm tra bằng cách xác định khối lượng của khối u, đếm tế bào ung thư, đếm tế bào khối u khả thi, đếm tế bào khối u, nghĩa là thời gian tồn tại và tăng tuổi thọ trong thí nghiệm mô hình động vật. Các chiết xuất làm tăng tuổi thọ của EAC xử lý chuột và phục hồi các thông số huyết học so với những con chuột mang EAC. Vì vậy, nghiên cứu cho biết rằng chiết xuất Methanol của Sài đất hoạt động chống ung thư trong mô hình động vật thử nghiệm.
Chất kích thích miễn dịch
Tác dụng miễn dịch của cây Sài đất đã được báo cáo bởi Prakash et al. (2011). Chất ức chế hệ thần kinh trung ương
Sài đất tìm thấy được tác dụng ảnh hưởng đến hệ thống thần kinh trung ương . Các chiết xuất từ gốc của Sài đất có tác động ước chế mạnh mẽ hệ thần kinh trung ương, chủ yếu là tương tự như của tác nhân thần kinh dược học (Suresh et al., 2010). Các chiết xuất ethanol của cây Sài đất đã được điều tra bởi những kiểm tra thần kinh dược học thông thường. Việc giảm trong hành vi tìm kiếm ở động vật là tương tự với các hành động của tác nhân ức chế hệ thần kinh trung ương khác. Một điều có ý nghĩa ở động cơ phối hợp và hoạt động giãn cơ cũng đã được ghi nhận ở động vật điều trị bằng chiết xuất từ dầu thô. Các kết quả chỉ ra rằng chiết xuất có hoạt động ức chế hệ thần kinh trung ương (Suresh et al., 2010).
Chất chống oxy hóa
Dựa vào các kết quả từ các mẫu chống oxy hóa trong trong phòng thí nghiệm chỉ ra rằng cây Sài đất được mô tả sơ lược như một chất chống oxy hóa hiệu quả và đáng kể .
Giảm đau chống viêm
Wedelolactone được tìm thấy trong cây Sài đất có 5-lipoxygenase và ức chế hoạt động của caspase.
Chiết xuất ethanol Sài đất đã được đánh giá cho hành động kháng viêm của nó bằng cách sử dụng trên carrageenan trung gian như histamine và serotonin gây phù nề chân, và bông pellet gây ra kiểm tra u hạt cho hiệu ứng của nó trên các mô hình giai đoạn viêm cấp tính và mãn tính ở chuột, cũng như các hoạt động giảm đau ở chuột. Nó đã cho thấy rằng chiết xuất axit acetixc gây ra một sự ức chế trên các phản ứng quằn quại gây ra một cách phụ thuộc liều. Liều 500 mg / kg chiết xuẩt ethanol Sài đất và aspirin có thể ngăn chặn các phản ứng quằn quại bởi 51,92% và 68,68% (P <0,001), tương ứng. Nó cũng đã chỉ ra rằng các chiết xuẩt ethanol Sài đất cho thấy tác dụng kháng viêm quan trọng trong phản ứng nóng tấm phương pháp thời gian ở chuột. Hiệu ứng này được so sánh với các loại thuốc morphine điều khiển điều trị tiêu chuẩn, cho thấy hoạt động trung tâm của chiết xuẩt ethanol Sài đất. Ức chế tối đa (56,14%) thu được ở liều 500 mg / kg sau 3 h của thuốc điều trị trong carrageenan gây phù nề chân, trong khi indomethacin (thuốc tiêu chuẩn) sản xuất 61,65% của sự ức chế. Trong mô hình kinh niên (u hạt bông pellet gây ra) các chiết xuẩt ethanol Sài đất (125, 250 và 500 mg / kg) và thuốc tiêu chuẩn cho thấy giảm sự hình thành của mô u hạt bằng 56,69%, 34,57%, 43,30% và 55,23% tương ứng. Kết quả cho thấy các thuốc giảm đau và chống viêm hiệu ứng mạnh và hiệu quả điều trị của Sài đấttrên mô hình động vật mà có thể so sánh với những loại thuốc tiêu chuẩn như Aspirin, Morphine và Indomethacin tương ứng.
Kháng khuẩn và kháng khuẩn
Các độc tế bào và hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết cây Sài đất với dung môi là dầu ether, chloroform và methanol đã được kiểm định bởi tôm ngâm nước muối sinh lý gây chết xét nghiệm sinh học và tiêu chuẩn hóa phương pháp khuếch tán đĩa chống lại vi khuẩn 19 chủng ở liều 0,5mg / đĩa cho thấy chiết xuất bởi dung môi ether, cloroform, methanol có tác dụng kháng khuẩn (Mottakin et al., 2004). Dịch chiết methanol của Sài đất cho thấy hoạt tính kháng khuẩn chống lại các sinh vật thử nghiệm với các vùng ức chế khác nhau, 8-17 mm và chiết acetone cho thấy vùng vô khuẩn khác nhau, 8-13 mm.
Ngoài ra cây Sài đất còn nhiêù tác dụng dược lý khác như chống loãng xương ở thời kì tiền mãn kinh, ức chế hoạt động của andropgen giảm tỷ lệ ung thư,ngăn ngừa ung thư, thanh nhiệt, giải độc, chống alcerogenic và bảo vệ niêm mạc, thuốc an thần, giảm căng thẳng.
PHẦN 3. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm bộ môn Ngoại Sản Khoa Thú y, Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Thực vật Khoa CNSH, Học Viện Nông nghiệp Việt Nam, các nông hộ tại các xã (Vĩnh Thịnh, An Tường, Vĩnh Ninh) thuộc huyện Vĩnh Tường, tỉnh Vĩnh Phúc.
Thời gian:từ 09/2016 đến 5/2017.
3.2. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 3.2.1. Bò sữa 3.2.1. Bò sữa
Bò sữa được nuôi tại các nông hộ thuộc các xã (Vĩnh Thịnh, An Tường, Vĩnh Ninh) huyện Vĩnh Tường, tỉnh Vĩnh Phúc.
3.2.2. Cao khô dược liệu Sài đất
Thân lá cây Sài đất (Wedelia calendulaceae Less), khô đã qua sơ chế được thu mua. Sơ chế lá theo quy trình sau: Cây tươi thu hái về được rửa dưới vòi nước sạch (2-3 lần) sau đó được sấy hoặc phơi khô ở 400C. Mẫu khô được nghiền thành bột mịn (<0,5mm). Bột lá đựng trong túi nilong bảo quản trong bình hút ẩm.
Bột dược liệu Sài đất được chiết với các dung môi bằng phương pháp ngâm chiết ở nhiệt độ phòng với cùng một tỷ lệ (5g bột dược liệu/50ml dung môi), mỗi ngày được lắc đảo 2 lần. Sau 72 giờ thu dịch chiết lọc qua vải màn và giấy lọc Whatman No.1. Thu dịch chiết đem cô, quay hút chân không để loại bỏ hoàn toàn dung môi. Tới khi khối lượng của bình cô quay không đổi đem cân để tính hiệu suất tách chiết của các dung môi. Cao cô toàn phần đã loại bỏ hết dung môi bảo quản trong tủ mát 40C để thử hoạt tính và khả năng ức chế vi khuẩn.
3.2.3. Vi khuẩn nghiên cứu
- Vi khuẩn Staphylococus spp. và Streptococus spp. phân lập từ dịch viêm tử cung bò được cung cấp từ phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Sinh học Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam (LAS – NN54; ISO 17025:2005).
3.2.4. Nano bạc
- Nano bạc có nồng độ gốc 100ppm, 90% các hạt nano bạc có kích thước 20 - 25 nm do bộ môn Sinh học khoa Công nghệ sinh học cung cấp.
3.2.5. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất thí nghiệm 3.2.5.1. Thiết bị, dụng cụ 3.2.5.1. Thiết bị, dụng cụ
Các thiết bị sử dụng trong quá trình thí nghiệm gồm có: tủ sấy, lò v sóng; tủ ấm nuôi vi khuẩn, tủ nuô v khuẩn lỏng lắc; cân phân tích; nồi hấp khử trùng autoclave; box cấy vô trùng; máy đo pH, máy l tâm, máy đo quang phổ, máy cô quay chân không.
Một số dụng cụ cần thiết như: Bình ống nghiệm, pipet man, đĩa petri, ống nghiệm, eppendof, đèn cồn, cốc thủy t nh, g á ống ngh ệm, bình định mức, ống ngh ệm.
3.2.5.2. Hóa chất - môi trường
+ Hóa chất
Các dung môi chiết: axit acetic 5%, ethanol 35%, ethanol 70%, ethanol 96%, nước cất, aceton nitril 50%, aceton nitril 100%.
Dung môi pha chất tan : Dimethyl sulphoxit (DMSO).
Các hóa chất định tính một số thành phần hóa học trong dịch chiết.
+ Môi trường Luria–Bertani (Gilbert) dạng lỏng, được hấp tiệt trùng trong các bình tam giác.
+ Môi trường LB rắn, được hấp tiệt trùng để nguội tới 400- 500C, đổ vào đĩa petri có đường kính 10 cm, với độ dày là 4 ± 0,2 mm.
3.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
o Khảo sát bệnh viêm tử cung trên đàn bò sữa ở một số địa phương thuộc huyện Vĩnh Tường tỉnh Vĩnh Phúc
o Phân lập và giám định thành phần vi khuẩn trong dịch tử cung của bò sữa
o Đánh giá hiệu suất và định tính các nhóm chất trong cao khô dịch chiết Sài đất sử dụng các dung môi tách chiết khác nhau
o Đánh giá khả năng ức chế vi khuẩn in vitro của cao dịch chiết trong các dung môi khác nhau với vi khuẩn phân lập từ dịch viêm tử cung bò
o Đánh giá Khả năng ức chế vi khuẩn Streptococcus spp. và Staphylococcus spp. của Nano bạc
o Đánh giá tác dụng ức chế vi khuẩn in vitro khi phối hợp nano bạc và cao dịch chiết
o Điều trị thử nghiệm bệnh viêm tử cung bò bằng cao khô dịch chiết Sài đất kết hợp với nano bạc
3.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
- Khảo sát tỷ lệ bò mắc bệnh viêm tử cung: Tiến hành kiểm tra tỷ lệ bò sữa bị viêm tử cung tại 03 xã thuộc huyện Vĩnh Tường tỉnh Vĩnh Phúc .
- Lấy mẫu dịch viêm tử cung bò: Tiến hành lấy mẫu dịch viêm tử cung bò trên đàn bò sữa được nuôi tại các nông hộ thuộc 03 xã thuộc huyện Vĩnh Tường tỉnh Vĩnh Phúc. Chuyển các mẫu sữa về phòng thí nghiệm của Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam.
- Xác định vi khuẩn gây bệnh viêm tử cung bò bằng phương pháp phân lập vi khuẩn: Vi khuẩn gây bệnh viêm tử cung được phân lập theo phương pháp thường qui (Nguyễn Như Thanh và cs., 2001). Nuôi cấy các dịch cần chẩn đoán vào các môi trường thông thường và môi trường đặc biệt để xác định các đặc tính nuôi cấy, đặc tính sinh vật, hoá học của từng loại vi khuẩn. Đối chứng là những mẫu dịch tử cung của bò khoẻ mạnh, bình thường trong cùng đàn.
Phương pháp pha dịch chiết nồng độ 100mg/ml: Lấy 1g cao cô toàn phần pha với 10ml Dimethyl sulfoxide (DMSO), dùng đũa thủy tinh khuấy tan hoàn toàn ta được dung dịch có nồng độ 100mg/ml.
Nuôi cấy vi khuẩn Staphylococus aureus. và Streptococus spp. trên môi trường rắn và lỏng: Vi khuẩn được cấy vạch trong môi trường LB đặc, trên đĩa petri ủ 370C/24 giờ, chọn khuẩn lạc đơn điển hình. Khuẩn lạc đơn được nuôi cấy trong bình tam giác với môi trường LB lỏng, ủ ở 370C, với tốc độ lắc 200 vòng/phút trong 12 - 14h; thu dịch khuẩn (mật độ vi khuẩn phải đạt 108 tế bào/ml là đạt chuẩn).
Xác định mật độ vi khuẩn:Mật độ vi khuẩn sau khi nuôi cấy trong môi trường LB lỏng được xác định theo phương pháp đo mật độ quang ở λ= 600nm.
+ Kiểm tra tác dụng diệt khuẩn của các dịch chiết bằng phương pháp kháng sinh đồ khuếch tán trên đĩa thạch của Kirby-Bauer.
đạt 108 tế bào/ml, lắc đều bình chứa vi khuẩn, dùng pipetman hút 100µl canh khuẩn nhỏ vào giữa đĩa thạch, dùng que thủy tinh tráng đều cho đến khi mặt thạch khô. Sau 15 phút đục lỗ trên mặt thạch với đường kính 6mm/lỗ, đục cách nhau khoảng 30mm. Mỗi lỗ thạch, nhỏ 100µl dịch chiết, đặt đĩa vào tủ ấm ở 370C/24 giờ đọc kết quả bằng cách đo đường kính vòng vô khuẩn, rồi tính số bình quân.
Phương pháp pha loãng các nồng động cao: Chuẩn bị sẵn 10 ống nghiệm sạch, vô trùng, cho vào mỗi ống 5 ml DMSO, đánh số thứ tự từ 1 đến 10. Ống nghiệm 1, được cho thêm 5ml dung dịch cao lỏng nồng độ 100mg/ml.Trộn đều dịch chiết trong ống nghiệm 1, sau đó hút 5 ml chuyển sang ống nghiệm 2, trộn đều; chuyển tiếp 5 ml từ ống nghiệm 2 sang ống nghiệm 3, trộn đều;… đến ống nghiệm thứ 10, trộn đều và bỏ đi 5 ml.
Phương pháp định tính xác định một số nhóm hợp chất có trong dịch chiết thực vật
Định tính saponin trong thực vật: Tính tạo bọt là tính chất đặc trưng của sapon n. Chúng tô dựa vào h ện tượng tạo bọt để định tính sự có mặt của Sapon n trong dịch ch ết.
- Quan sát hiện tượng tạo bọt: Cho vào ống nghiệm lớn 5 g ọt dịch ch ết ở mỗ loạ , thêm 5ml nước. Lắc mạnh trong 5 phút. Để yên và quan sát hiện tượng tạo bọt. Nếu bọt còn bền vững sau 15 phút thì sơ bộ kết luận thực vật có chứa saponin.
Định tính flavonoid
- Phản ứng với kiềm: Nhỏ một giọt dịch chiết lên giấy lọc. Hơ khô rồi để lên miệng lọ amoniac đặc đã được mở nút, sẽ thấy màu vàng của vết dịch chiết được tăng lên. Nhỏ một giọt khác làm chứng.