ethanol 70% trên vi khuẩn phân lập từ dịch viêm tử cung bò khi pha loãng
Nhằm nghiên cứu sâu hơn về khả năng ức chế vi khuẩn in vitro của dịch chiết dược liệu Sài đất trong dung môi ethanol 70% và aceton nitril 100%, cũng như tìm ra nồng độ thấp nhất khi pha loãng có khả năng ức chế vi in vitro đối với 02 chủng vi khuẩn phân lập cũng như kiểm chứng để lựa chọn liều điều trị thử nghiệm, chúng tôi tiến hành thí nghiệm pha loãng dịch chiết để kiểm tra khả năng diệt khuẩn in vitro.
Bằng phương pháp pha loãng liên tiếp cao dịch chiết Sài đất sử dụng dung môi ethanol 70% và aceton nitril ở nồng độ 100mg/ml với hệ số pha loãng ½, sau đó, tiến hành kiểm tra khả năng diệt khuẩn in vitro trên môi trường thạch.
Thông qua sự có hay không xuất hiện của vòng vô khuẩn, có thể xác định nồng độ tối thiểu thấp nhất của dịch chiết dược liệu Sài đất có thể ức chế sự phát triển của vi khuẩn, kết quả được thể hiện ở bảng 4.8.
Kỹ thuật này nhằm mục đích xác định chính xác nồng độ nhỏ nhất của dịch chiết lá cây Sài Đất có tác dụng ức chế sự phát triển của một chủng vi khuẩn trong môi trường nuôi cấy (phương pháp định lượng). Dựa theo nguyên lý nồng độ kháng sinh (dịch chiết) tăng dần trong môi trường nuôi cấy, khi đạt đến một nồng độ nhất định nó sẽ ức chế được sự phát triển của vi khuẩn và bằng mắt thường đã có thể xác định được điều này thông qua quan sát sự xuất hiện có hay không có vòng vô khuẩn.
Bảng 4.8. Khả năng ức chế vi khuẩn khi pha loãng cao khô dịch chiết dược liệu Sài đất
khuẩn 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024 Nồng độ cao khô dịch chiết lá cây Sài đất, mg/ml
50 25 12,50 6,25 3,13 1,56 0,78 0,39 0,20 0,10
Cao khô dịch chiết sử dung dung môi aceton nitril 100%
Sta. + + + + + + + - - -
Strep. + + + + + + + + - -
Cao khô dịch chiết sử dung dung môi ethanol 70%
Sta. + + + + + + + + + -
Strep. + + + + + + + + - -
Ghi chú: (+) : Có đường kính vòng vô khuẩn (-) : Không có đường kính vòng vô khuẩn.
Kết quả nghiên cứu cho thấy, cao khô dịch chiết sử dụng dung môi aceton nitril 100% (100mg/ml) pha loãng lớn nhất 256 lần với nồng độ tương ứng là 0,391 mg/ml vẫn còn khả năng ức chế in vitro vi khuẩn Streptococcus spp. Đối với vi khuẩn Staphylococcus nồng độ tối thiểu khi pha loãng vẫn còn quan sát thấy vòng vô khuẩn là 0,78 mg/ml tương đương với hệ số pha loãng 128 lần.
Cao khô dịch chiết sử dụng dung môi ethanol 70%(100mg/ml) pha loãng lớn nhất 512 lần với nồng độ tương ứng là 0,20 mg/ml vẫn còn khả năng ức chế in vitro vi khuẩn Streptococcus spp. Đối với vi khuẩn Staphylococcus spp. nồng độ tối thiểu khi pha loãng vẫn còn quan sát thấy vòng vô khuẩn là 0,78 mg/ml tương đương với hệ số pha loãng 256 lần.
Khi so sánh với kết quả nghiên cứu của Phạm Thị Dung (2015) cho thấy, khả năng ức chế vi khuẩn in vitro của cao khô dịch chiết Sài đất tốt hơn so với cao khô dịch chiết Đơn đỏ. Trong nghiên này nồng độ nhỏ nhất khi pha loãng cao khô dịch chiết Đơn đỏ vẫn còn khả năng ức chế vi khuẩn in vitro là 1,56 mg/ml đối với vi khuẩn Staphylococcus spp.
Khả năng ức chế vi khuẩn in vitro của cao khô dịch chiết Sài đất khi pha loãng tương đương với cao khô dịch chiết Huyền diệp sử dụng dung môi ethanol 70%. Theo nghiên cứu của Khúc Huy Hoàng (2015) cho thấy nồng độ nhỏ nhất cao khô dịch chiết Huyền diệp có tác dụng ức chế vi khuẩn Streptococcus spp. và Staphylococcus spp. gây viêm vú bò là 0,02 mg/ml.
4.5. ĐÁNH GİÁ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ Vİ KHUẨN STREPTOCOCCUS
SPP. VÀ STAPHYLOCOCCUS SPP. CỦA NANO BẠC
Từ lâu loài người đã biết đến tác dụng sát khuẩn mạnh của bạc, những chén bát, thìa nĩa, nồi niêu của người La Mã cổ, của các vua chúa phong kiến,.. đã chứng minh điều đó. Trong chiến tranh thế giới thứ nhất, người ta thậm chí còn sử dụng các sản phẩm từ bạc để điều trị nhiễm trùng trước khi thuốc kháng sinh ra đời. Tuy nhiên, tác dụng này của bạc không được ứng dụng rộng rãi do giá thành cao. Những năm gần đây, công nghệ nano ra đời, con người đã chế tạo được bạc ở kích thước nano, và ứng dụng của bạc cũng được đưa lên một tầm cao mới. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng khi ở kích thước nano (từ 1 đến 100nm), hoạt tính sát khuẩn của bạc tăng lên khoảng 50000 lần so với bạc dạng khối, Điều này sẽ giúp cho khối lượng bạc sử dụng trong các sản phẩm sẽ giảm rất mạnh, nên tỷ trọng của bạc trong giá thành trở nên không đáng kể. Nano bạc không chỉ được ứng dụng trong lĩnh vực y tế mà cả trong công nghệ thực phẩm và sản xuất hàng tiêu dùng bởi tác dụng kháng khuẩn của nó mà không gây ô nhiễm môi trường. Trong chăn nuôi, nano bạc cũng đã được đưa vào để phòng, điều trị và diệt các nguồn bệnh từ vi khuẩn, virus và bào tử nấm gây ra cho thủy sản. Tuy nhiên các nghiên cứu này còn hạn chế, đặc biệt là công tác phòng và trị bệnh cho gia súc, gia cầm, nhất là khi hiện tượng kháng thuốc diễn ra phổ biến.
Nhằm khẳng định khả năng diệt khuẩn in vitro cũng như ứng dụng Nano bạc trong phòng và trị bệnh cho vật nuôi nói chung và bệnh viêm tử cung bò nói riêng chúng tôi tiến hành thí nghiệm đánh giá khả năng diệt khuẩn in vitro của nano bạc đến vi khuẩn phân lập từ dịch viêm tử cung bò.
Bằng phương pháp trộn trực tiệp dịch khuẩn với dung dịch Nano bạc, sau đó cấy chang trên môi trường đặc, sau 24h quan sát và phân tích kết quả.
Khi sử dụng 50µl vi khuẩn +50µl dung dịch nano bạc ở nồng độ gốc 100 ppm trộn đều trước khi cấy chang trên bề mặt thạch cho thấy, sau 24h quan sát trên bề mặt thạch với cả 02 chủng vi khuẩn đều không thấy xuất hiện khuẩn lạc chứng tỏ khả năng diệt khuẩn in vitro của Nano bạc. Trong khi đó ở đĩa đối chứng khi sử dụng 50µl vi khuẩn +50µl nước cất đối với cả 02 chủng vi khuẩn đều thấy sau 24h đã thấy vi khuẩn mọc phủ đầy trên bề mặt thạch (Hình 4.7).
Để kiểm tra tác dụng diệt khuẩn in vitro của nano bạc, tiến hành pha loãng dung dịch Nano bạc để đánh giá tác dụng đối với các vi khuẩn thử nghiệm.
Kết quả thí nghiệm được thể hiện ở bảng 4.9.
Bảng 4.9. Kết quả khảo sát hoạt tính diệt khuẩn in vitro của dung dịch nano bạc đối với vi khuẩn Streptococcus spp. và Staphylococcus spp.
Vi khuẩn Đối chứng
Hệ số pha loãng dd nano bạc
20 21 22 23 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nồng độ nano bạc (ppm)
100 50 25 12,5
Streptococcus spp. không có có không không
Staphylococcus spp. không có có không không
Đối chứng 100 ppm 50 ppm 25 ppm
Streptococcus spp. phân lập từ dịch viêm tử cung bò
Staphylococcus spp. phân lập từ dịch viêm tử cung bò
Hình 4.7. Tác dụng ức chế vi khuẩn in vitro của Nano bạc khi pha loãng
Kết quả nghiên cứu (bảng 4.9, hình 4.7) cho thấy, dung dịch nano bạc khi sử dụng phương pháp trộn với dịch khuẩn trước khi cấy trang đã có tác dụng diệt khuẩn tức thời. Khi nồng độ nano bạc giảm dần thì tác dụng ức chế sự phát triển của vi khuẩn cũng giảm. Ở nồng độ 100ppm thì trên mặt thạch sau 24 h nuôi cấy xuất hiện < 3 khuẩn lạc chứng tỏ ở nồng độ này bạc nano có tác dụng diệt khuẩn.
Ở các nồng độ nhỏ hơn khi pha loãng đã thấy xuất hiện trên mặt thạch nhiều khuẩn lạc hơn. Ở nồng độ 50 ppm tức là pha loãng 2 lần thì số lượng khuẩn lạc vẫn còn quan sát thấy sự sai khác rõ ràng so với đối chứng đối với cả 2 chủng vi khuẩn thử nghiệm. Ở các nồng độ nhỏ hơn, trên bề mặt thạch xuất hiện nhiều khuẩn lạc hơn không còn quan sát thấy sự sai khác rõ ràng so với đối chứng (hình 4.7). Bằng phương pháp trộn dịch khuẩn và nano bạc trước khi cấy trang nồng độ nano bạc nhỏ nhất vẫn còn quan sát thấy sự sai so với đối chứng là 50 ppm.
4.6. ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG ỨC CHẾ VI KHUẨN IN VITRO KHI PHỐI HỢP NANO BẠC VÀ CAO DỊCH CHIẾT HỢP NANO BẠC VÀ CAO DỊCH CHIẾT
Các đặc tính kháng khuẩn của bạc bắt nguồn từ tính chất hóa học của các ion Ag+. Ion này có khả năng liên kết mạnh với peptidoglican, thành phần cấu tạo nên thành tế bào của vi khuẩn và ức chế khả năng vận chuyển oxy vào bên trong tế bào dẫn đến làm tê liệt vi khuẩn. Nếu các ion bạc được lấy ra khỏi tế bào ngay sau đó, khả năng hoạt động của vi khuẩn lại có thể được phục hồi. Trên đây chính là một trong những giả thuyết giải thích cơ chế diệt khuẩn của nano bạc.
Do lượng nano bạc sử dụng ít nên đôi khi xảy ra hiện tượng phục hồi của vi khuẩn. Việc nano bạc có kích thước nhỏ có khả năng liên kết với thành tế bào, một trong những cơ quan quan trọng của vi khuẩn trong việc ngăn cản các tác nhân bên ngoài xâm nhập để tiêu diệt vi khuẩn. Dựa trên tính năng này việc phối hợp nano bạc có chức năng phá thành bào của vi khuẩn với tác nhân bên ngoài ở đây là dịch chiết thực vật thì rất có thể nano bạc làm tăng khả năng diệt khuẩn của dịch chiết thực vật.
Dựa trên những lý do trên, thí nghiệm phối hợp nano bạc và cao khô dịch chiết dược liệu Sài đất được tiến hành. Cao khô dịch chiết ở đây chúng tôi dùng cao khô dịch chiết Sài đất sử dụng dung môi ethanol 70% để tiến hành thí nghiệm vì cao này có tác dụng ức chế vi khuẩn in vitro tốt nhất khi phap loãng. Nồng độ nano bạc được sử dụng là 25 ppm ở thể tích 20µl, ở nồng độ này theo thí nghiệm trên thì không có ảnh hưởng tức thời đến sự sinh trưởng và phát triển của các chủng vi khuẩn thí nghiệm. Nồng độ dịch chiết được sử dụng là ½ MIC, MIC, 2 MIC, 4 MIC,...(MIC là nồng độ nhỏ nhất của dịch chiết vẫn còn quan sát thấy vòng vô khuẩn ) ở thể tích 80µl.
Kết quả thí nghiệm cho thấy, khi có bổ sung nano bạc vào dịch chiết dược liệu Sài đất đều làm tăng khả năng ức chế vi khuẩn in vitro của cao dịch chiết.
Khi dịch chiết ở nồng độ cao, tác dụng của nano bạc làm tăng khả năng ức chế của dịch chiết chưa rõ ràng, nhưng khi dịch chiết ở nồng độ nhỏ hiệu quả tăng khả năng ức chế của dịch chiết rất rõ. Khi bổ sung nano bạc vào dịch chiết, không chỉ đường kính vòng vô khuẩn tăng lên mà vòng vô khuẩn rõ ràng và sắc nét hơn so với khi không bổ sung nano bạc.
Đặc biệt khi sử dụng riêng lẻ cao khô dịch chiết Sài đất, ở nồng độ 0,39 mg/ml (tương đương pha loãng 256 lần) đã không quan sát thấy vòng vô khuẩn đối với vi khuẩn Streptococcus spp. Trong khi đó cao dịch chiết bổ sung nano bạc ở nồng độ 0,20 vẫn còn quan sát thấy vòng vô khuẩn
Bảng 4.10. Khả năng ức chế vi khuẩn khi pha loãng cao khô dịch chiết dược liệu Sài đất (sử dụng dung môi ethanol 70%) phối hợp với nano bạc
Tên vi khuẩn
Có/Không bổ sung nano bạc
Hệ số pha loãng cao khô dịch chiết Sài đất (100mg/ml) 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024
Nồng độ cao khô dịch chiết lá cây Sài đất, mg/ml
50 25 12,50 6,25 3,13 1,56 0,78 0,39 0,20 0,10 Sta. Không + + + + + + + + + - Có + + + + + + + + + - Strep. Không + + + + + + + + - - Có + + + + + + + + + - A B A B Streptococcus spp. Staphylococcus spp.
Hình 4.8. So sánh khả năng ức chế vi khuẩn in vitro của cao dịch chiết có và
không bổ sung nano bạc
4.7. SỬ DỤNG CAO DỊCH CHIẾT SÀI DẤT KẾT HỢP VỚI NANO BẠC ĐỂ ĐIỀU TRỊ THỬ NGHIỆM BÒ BỊ VIÊM TỬ CUNG
Để kiểm chứng hiệu quả thực tế của dịch chiết Sài đất trong dung môi ethanol 70% chúng tôi tiến hành điều trị thử nghiệm trên bò bị viêm tử cung. Căn cứ hiệu suất chiết xuất của Sài đất trong dung môi ethanol 70% và dựa theo phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý của thuốc từ dược liệu (Viện Dược liệu, 2006), chúng tôi lựa chọn liều dùng điều trị thử nghiệm cho bò là 10 mg/kg thể trọng.
Chúng tôi lựa chọn phác đồ điều trị viêm tử cung thường được các bác sỹ thú y sử dụng làm đối chứng.
Chúng tôi tiến hành thử nghiệm theo 03 phác đồ như sau
* Phác đồ 1: Thụt rửa tử cung bằng dung dịch Rivanol 0,1% ngày 1 lần, sau khi thụt rửa kích thích cho dung dịch thụt rửa chảy hết ra ngoài, dùng Norfloxacin 5mg/kg thể trọng pha với 100ml nước cất bơm vào tử cung; kết hợp điều trị toàn thân bằng ADE, B.complex. Liệu trình điều trị không quá 5 ngày. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
* Phác đồ 2: Thụt rửa tử cung bằng dung dịch Rivanol 0,1% ngày 1 lần, sau khi thụt rửa kích thích cho dung dịch thụt rửa chảy hết ra ngoài, dùng cao khô dịch chiết Sài đất 10 mg/kg thể trọng pha với 100ml nước cất bơm vào tử cung; kết hợp điều trị toàn thân bằng ADE, B.complex. Liệu trình điều trị không quá 5 ngày.
* Phác đồ 3: Thụt rửa tử cung bằng dung dịch Rivanol 0,1% ngày 1 lần, sau khi thụt rửa kích thích cho dung dịch thụt rửa chảy hết ra ngoài, dùng cao khô dịch chiết Sài đất 10 mg/kg thể trọng pha với 100ml nước cất và bổ sung nano bạc đến nồng độ 25 ppm bơm vào tử cung; kết hợp điều trị toàn thân bằng ADE, B.complex. Liệu trình điều trị không quá 5 ngày.
Thử nghiệm được thực hiện trên 36 bò cái mắc bệnh viêm nội mạc tử cung, kết quả được trình bày tại bảng 4.11 và biểu diễn trên hình 4.9.
Qua bảng 4.11 chúng tôi nhận thấy, trong tổng số 36 bò chỉ định điều trị có 34 bò khỏi bệnh. Điều trị 9 bò theo phác đồ II có 8 bò khỏi bệnh, đạt tỷ lệ thấp nhất là 88,89%; phác đồ III điều trị cho 12 bò thì có 11 con khỏi bệnh đạt 91,67%. Ở phác đồ 1 điều trị 15 bò thì cả 15 bò đều khỏi bệnh. Tuy nhiên, thời gian điều trị trung bình ở phác đồ I là ngắn nhất, chỉ có 3,93 ngày, trong đó phác đồ III là 4,18 ngày và phác đồ II có thời gian điều trị trung bình dài nhất là 4,38 ngày.
Bảng 4.11. Kết quả thử nghiệm điều trị bò mắc bệnh viêm tử cung
Phác đồ
Số bòthử nghiệm
Thời gian điều trị Tổng hợp 3 ngày 4 ngày 5 ngày
Tổng số con khỏi Tỷ lệ (%) Thời gian điều trị TB (ngày) Số con khỏi Tỷ lệ (%) Số con khỏi Tỷ lệ (%) Số con khỏi Tỷ lệ (%) I 15 4 26.67 8 53.33 3 20.00 15 100.00 3.93 II 9 0 0.00 5 55.56 3 33.33 8 88.89 4.38 III 12 1 8.33 7 58.33 3 25.00 11 91.67 4.18
Hình 4.9. Kết quả điều trị thử nghiệm trên bò mắc bệnh viêm tử cung
Ở phác đồ I, sau 3 ngày điều trị với kháng sinh và thuốc bổ trợ sức đã có 4/15 bò khỏi bệnh đạt 26,67%. Tỷ lệ điều trị khỏi cao nhất phác đồ này đạt được ở ngày thứ 4 với 8/15 bò khỏi bệnh, đạt 53,33%. Số bò khỏi bệnh ở ngày thứ 5 là 3/15 bò đạt tỷ lệ 20,00%. Số ngày điều trị trung bình ghi nhận được là 3,93 ngày.
Ở phác đồ II sử dụng cao khô dịch chiết Sài đất và thuốc bổ trợ sức, ở ngày điều trị thứ 3 không ghi nhận ca khỏi bệnh nào. Tỷ lệ điều trị khỏi cao nhất phác đồ này đạt được ở ngày thứ 4 với 5/9 bò khỏi bệnh, đạt 55,56%. Số bò khỏi bệnh ở ngày thứ 5 là 3 bò đạt tỷ lệ 33,33%. Số ngày điều trị trung bình ghi nhận