Phần 4 Kết quả và thảo luận
4.3.1.Hiệu suất tách chiết cao khô dịch chiết Sài đất sử dụng các dung môi tách
4.3. Đánh giá hiệu suất và định tính các nhóm chất trong cao khô dịch chiết
4.3.1.Hiệu suất tách chiết cao khô dịch chiết Sài đất sử dụng các dung môi tách
4.3.1. Hiệu suất tách chiết cao khô dịch chiết Sài đất sử dụng các dung môi tách chiết khác nhau tách chiết khác nhau
Chiết xuất là phương pháp dùng các dung môi khác nhau để lấy chất tan ra khỏi mô thực vật. Dịch chiết là sản phẩm ta thu được trong quá trình này là dung dịch chứa các chất hòa tan trong dung môi đó. Các yếu tố như bản chất của chất tan, dung môi, nhiệt độ, áp suất, cấu tạo vách tế bào hay kích thước tiểu phân bột dược liệu… ảnh hưởng trực tiếp lên qua trình tách chiết và chúng cũng sẽ quyết định chất lượng của dịch chiết ta thu được. Có hai phương pháp chiết tách dược liệu là ngâm lạnh và chiết kiệt. Dựa vào điều kiện phòng thí nghiệm và yêu cầu tôi sử dụng phương pháp chiết ngâm lạnh.
Từ 1000g thân và lá cây Sài đất sau khi sấy khô và xay nhỏ thu được từ 250-260g bột thân và lá khô.
Chúng tôi tiến hành thu dịch chiết Sài đất trong các loại dung môi: nước cất, acid acetic 5%, ethanol 35%, ethanol 70% và aceton nitril 100%.
Sau kh t ến hành ngâm bột cây Sà đất trong 5 loạ dung mô có độ phân cực khác nhau sau 72 g ờ lọc sơ bộ qua vả màn và g ấy lọc. Kết quả cho thấy,
cùng một tỷ lệ pha loãng nhưng dịch chiết thu được từ các dung môi lại có các mầu sắc khác nhau. Với ethanol 70% và aceton nitril 100% thể tích dịch chiết thu được lớn và cao khô dịch chiết có màu xanh đen. Còn với ba dung môi còn lại thể tích thu được nhỏ hơn và cao dịch chiết màu sắc vàng nâu khác biệt (Hình 4.2). Qua màu sắc khác nhau của dịch chiết có thể sơ bộ nhận định rằng, các dung môi khác nhau có khả năng lôi kéo các hoạt chất trong Sài đất là khác nhau.
Hình 4.2. Màu sắc dịch chiết và cao dịch chiết sài đất khi sử dụng các dung môi khác nhau
Ghi chú: từ trái sang phải lần lượt là: nước- acid acetic 5%- ethanol 35%- ethanol 70%- aceton nitril
Tiến hành cô đuổi dung môi bằng máy cất quay chân không cho đến khi được cao khô có khối lượng không đổi. Khối lượng cao khô và hiệu suất chiết được thể hiện ở bảng 4.4 và hình 4.2.
Bảng 4.4. Hiệu suất tách chiết Sài đất trong các loại dung môi khác nhau nhau
STT Dung môi
Khối lượng bột Sài đất ban đầu,
g
Khối lượng trung bình cao khô dịch chiết
(TB ± s), g Hiệu suất, % 1 Nước cất 5 0,21 ± 0,02 4,2 2 Acid acetic 5% 0,40 ± 0,05 8,0 3 Ethanol 35% 0,64 ± 0,06 12,8 4 Ethanol 70% 0,86 ± 0,02 17,2 5 Aceton nitril 100% 0,81 ± 0,06 16,2
Chú thích:TB: Là khối lượng trung bình của cao khô dịch chiết qua các lần lặp lại thí nghiệm; s: độ lệch thực nghiệm chuẩn có hiệu chỉnh.
Sử dụng dung môi nước, một dung môi thông dụng dễ kiếm, giá rẻ, nhưng dễ thấm vào dược liệu do có độ nhớt thấp và sức căng bề mặt nhỏ; là dung môi phân cực protic có khả năng hòa tan muối alkaloid, một số glycosid, đường, chất nhầy.... Tiến hành thu hồi dung môi bằng máy cô quay cho khối lượng cao khô trung bình là từ 5 g bột khô Sài đất là 0,21±0,02 g tương ứng với hiệu suất là 8,50%.
Sử dụng dung môi Ethanol, đây là một dung môi thông dụng thường được sử dụng trong đông dược, là dung mô phân cực prot c, hòa tan được alkaloid, tinh dầu, nhựa, glycosid, ít hòa tan tạp chất. Mặt khác, ethanol không làm trương nở dược liệu như dung môi nước. Tiến hành thu hồi dung môi bằng máy cô quay cho kết quả khối lượng cao khô trung bình tùy thuộc vào nồng độ ethanol là 0,64±0,06 g (ethanol 35%) và 0,86±0,02 g (ethanol 70%) và có hiệu suất tương ứng lần lượt là 12,8% và 17,2 %.
Axit axetic lỏng là dung môi protic dính ướt (phân tử phân cực), tương tự như ethanol và nước. Với hằng số điện môi trung bình khoảng 6,2, nó có thể hoà tan không chỉ trong các hợp chất phân cực như các muối vô cơ và các loại đường mà nó còn có khả năng hòa tan trong các hợp chất không phân cực như dầu, và các nguyên tố như lưu huỳnh và iốt. Tiến hành thu hồi dung môi bằng máy cô quay cho kết quả khối lượng cao khô trung bình là 0,40±0,05 g tương ứng với hiệu suất là 8,0 %.
Aceton nitril còn được gọi là methyl nitrile acetonitrile, chất lỏng không màu, rất dễ bay hơi, có mùi đặc biệt như ether, có tính chất dung môi tuyệt vời và có thể hòa tan nhiều chất hữu cơ, vô cơ và khí. Aceton nitril là một dung môi có điểm sôi và đông đặc tương đối thấp nên dễ dàng tách dung môi ra khỏi dịch chiết. Là dung môi phân cực aprotic có khả năng tách được rất nhiều các chất như acid amin, flavonoid, chất béo,... nhưng không tách được alkaloid ra khỏi dược liệu. Tiến hành thu hồi dung môi bằng máy cô quay cho kết quả khối lượng cao khô trung bình là 0,81±0,06 g tương ứng với hiệu suất là 16,2 %.
Khi tiến hành đánh giá hiệu suất tách chiết của cao khô dịch chiết Sài đất qua 03 lần tách chiết, chúng tôi thấy đều cùng một phương pháp chiết ngâm lạnh nhưng hiệu suất chiết xuất khi sử dụng các loại dung môi là khác nhau. Như vậy có thể nhận định rằng, các loại dung môi tách chiết khác nhau thì khả năng hòa tan các hợp chất trong thực vật khác nhau. Khối lượng cao
khô dịch chiết Sài đất từ 05 g bột lá ban đầu, tùy thuộc vào từng loại dung môi có độ giao động khá lớn biến đổi từ 0,21±0,02 g (dung môi nước) đến 0,86±0,06 g (dung môi ethanol 70%).
Trong 5 loại dung môi sử dụng đa phần là dung môi phân cực protic, chỉ có Aceton nitril là dung môi phân cực aprotic tuy nhiên khi sử dụng dung môi phân cực protic (ethanol 70%) và dung môi phân cực aprotic (aceton nitril 100%) cũng cho khối lượng cao khô tương đương nhau.
Kết quả thí nghiệm cho thấy khả năng hòa tan các hoạt chất có trong Sài đất không chỉ phụ thuộc vào độ phân cực của dung môi mà còn phụ thuộc vào bản chất của dung môi
Hình 4.3. Hiệu suất tách chiết Sài đất sử dụng các loại dung môi khác nhau 4.3.2. Định tính xác định một số nhóm hoạt chất hòa tan trong cao khô dịch chiết lá Sài đất bằng phương pháp hóa học
Sử dụng các phản ứng định tính đặc trưng để kiểm tra sự hiện diện của các nhóm hoạt chất trong dược liệu nhằm như phản ứng kết tủa, tạo màu đặc trưng của các nhóm hoạt chất. Đây là phương pháp định tính xác định đơn giản, nhanh chóng, dễ dàng thực hiện ngay trong phòng thí nghiệm. Các thuốc dễ kiếm, ít độc cho người thí nghiệm, cho kết quả nhanh, tương đối chính xác (Trần Danh Thế và cs., 2010).
Áp dụng các phản ứng định tính này để xác định một số nhóm hoạt chất có trong cao khô dịch ch ết lá Sài đất thu được kh sử dụng các loại dung môi
tách chiết khác nhau (nước cất, acid acetic 5%, ethanol 35%, ethanol 70% và aceton nitril 100%.). Kết quả định tính sơ bộ thành phần hóa học trong cao khô dịch chiết Sài đất sử dụng các dung môi khác nhau được trình bày ở bảng 4.5.
Bảng 4.5. Kết quả định tính sơ bộ thành phần hóa học của cao khô dịch chiết Sài đất sử dụng dung môi khác nhau
PƯ Tên nhóm chất Phản ứng định tính Kết quả Dịch chiết Nướ c cất A.acetic 5% Eth 35% Eth 70% A.nitril 100% 1 Đường khử Fehling A, B Đỏ gạch - + + + +
2 Polyphenol FeCl3 5% xanh đen + + + + + (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3 Saponins Pư tạo bọt Tạo bọt - - + + -
4 Carotenoid H2SO4 Màu xanh - - - - +
5 Alkaloids
Mayer Tủa + + + + -
Bouchardat Tủa + + + + -
Dragendorf Tủa + + + + -
6 Flavanoids Với NH3 Màu vàng + + + + +
7 Tanin Với dd FeCl3 Tủa đen + + + + +
8 Phytosterol Anhydric acetic+H2SO4 Có màu xanh nhạt + + + + +
9 Chất nhầy Chì axetate Tủa nâu - - + + +
10
Chất béo Vết mờ trên giấy lọc
Vết mờ - - + + +
Kết quả (số PƯ dương tính/tổng số PƯ) 5/10 6/10 9/10 9/10 8/10
Chú thích : +: Dương tính, -: Âm tính, Met: Methanol Eth: Ethanol, Aceton, Ac.nit: Aceton nitril.
Qua kết quả định tính xác định các nhóm hoạt chất trong cao dịch chiết Sài đất được trình bày ở bảng 4.5 cho ta thấy, cao khô dịch chiết lá Sài đất sử dụng các dung môi khác nhau có các nhóm thành phần hoạt chất khác nhau.
● Qua kết quả định tính thì cao khô dịch chiết Sài đất có ít nhóm hoạt chất nhất (5/10). Do nước là dung môi có khả năng hòa tan nhiều tạp chất trong đó có các enzyme nội sinh. Enzyme này xúc tác gây ra các phản ứng thủy phân hoạt chất (glycosid, chất béo...). Nên khi tiến hành định tính chúng tôi chỉ thu được: Polyphenol, Alkaloids, alkaloid, Flavanoids, Tanin và Phytosterol.
phản ứng cho kết quả dương tính với các phản ứng định tính. Như đã phân tích ở trên dung môi ethanol hòa tan được rất nhiều các hợp chất thứ cấp trong dược liệu nhưng lại ít hòa tan tạp chất nên hợp chất trong nó không bị thủy phân; nhiệt độ sôi tương đối thấp nên hoạt chất tách chiết được cũng không bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ. Vì vậy, khi định tính các nhóm hoạt chất trong cao khô dịch chiết là Sài đất sử dụng dung môi ethanol chúng tôi thu được: Alkaloid, Flavonoid, Phytosterol, Polyphenol, đường khử, Saponin, Tanin, chất béo và chất nhầy. Chỉ khi sử dụng dung môi ethanol mới có khả năng lôi kéo saponin có trong lá Sài đất. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với kết quả nghiên cứu của (Padmapriya and Poonguzhali, 2015), khi thấy trong bột Sài đất có saponin
● Cao khô dịch chiết sử dụng dung môi acid acetic 80% có 6/10 phản ứng cho kết quả dương tính. Các nhóm hoạt chất dương tính bao gồm: Polyphenol, Alkaloids, Flavanoids, Tanin, Phytosterol và đường khử.
● Với dung môi Aceton nitril 100%, có 8/10 nhóm chất có trong cao khô dịch chiết bao gồm: Flavonoid, Phytosterol, Polyphenol, đường khử, Tanin, Carotenoid, chất nhày và chất béo. Chỉ duy nhất khi sử dụng dung môi có khả năng lôi kéo được carotenoid có trong lá cây Sài đất.
Đánh giá chung, sử dụng các phản ứng định tính xác định đặc trưng để k ểm tra sơ bộ các thành phần hóa học của cao khô dịch chiết Sài đất cho thấy, trong dịch ch ết có 10 loạ nhóm chất khác nhau (alkalo d, flavono d, phytosterol, polyphenol, tanin, saponin, carotenoid, đường khử, chất béo, chất nhầy). Tùy từng loạ dung mô mà khả năng lô kéo các nhóm chất ra khỏ lá cây Sài đất là khác nhau (Hình 4.4). Dung mô ethanol lô kéo được nh ều loạ nhóm chất nhất (9 loạ ), sau đó là Aceton n tr l (8 loạ ) và cuố cùng là nước cất chỉ vớ 5 loạ nhóm chất (Bảng 4.5). Khi tiến hành các phản ứng định tính để xác định thành phần các hợp chất có trong cao khô dịch chiết lá Sài đất sử dụng các dung môi tách chiết khác nhau chúng tôi nhận thấy, các loại dung môi tách chiết khác nhau đều có thể lôi kéo các nhóm chất khác nhau, do đó việc sử dụng dung môi tách chiết nào có khả năng lôi kéo được các nhóm chất có khả năng kháng khuẩn có ảnh hưởng rất lớn đến các kết quả nghiên cứu. Kết quả nghiên cứu cho thấy khi sử dụng 05 loại dung môi tách chiết khác nhau thì các dung môi này đều lôi kéo được nhóm chất flavonoid lànhóm chất có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm cao.
A B C
D E F
Hình 4.4. Phản ứng định tính xác định các nhóm hoạt chất có trong cao dịch chiết lá Sài đất
Ghi chú: A -Phản ứng thử chất nhầy tạo tủa bông của cao dịch chiết sử dung dung môi ethanol 35%;
B- Phản ứng thử tanin tạo kết tủa đen của dịch chiết sử dụng dung môi Aceton nitril 100%;C- Phản ứng
thử đường khử tạo mầu của cao dịch chiết sử dụng dung môi ethanol 35% và Aceton nitril; D- Phản ứng thử flavonoid của dịch chiết sử dung dung môi Acid acetic (màu vàng của vết dịch chiết được tăng lên);
E - Phản ứng thử alkaloid với thuốc thử Mayer của dịch chiết dung môi nước cất; F- Phản ứng thử saponin tạo bọt của dịch chiết sử dụng dung môi ethanol 70%;
4.4. ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ VI KHUẨN IN VITRO CỦA CAO DỊCH CHIẾT TRONG CÁC DUNG MÔI KHÁC NHAU VỚI VI KHUẨN DỊCH CHIẾT TRONG CÁC DUNG MÔI KHÁC NHAU VỚI VI KHUẨN PHÂN LẬP TỪ DỊCH VIÊM TỬ CUNG BÒ
Sau khi thu được cao khô dịch chiết ở thí nghiệm trên, chúng tôi tiến hành pha cao dịch chiết bằng dung môi DMSO đạt nồng độ 100mg/ml để tiến hành thí nghiệm, đánh giá khả năng diệt khuẩn in vitro của các loại dịch chiết trong các dung môi khác nhau đối với các vi khuẩn phân lập. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
4.4.1. Khả năng ức chế in vitro của cao khô dịch chiết sử dụng các dung môi
khác nhau trên vi khuẩn Staphylococcus spp phân lập từ dịch viêm tử cung bò
Ampicillin là kháng sinh thuộc nhóm β-Lactamin, có phổ rất rộng, tác dụng cả với vi khuẩn gram (+), gram (-), tác dụng mạnh trên tụ cầu, liên cầu và cả trực khuẩn gây mủ xanh. Nên chúng tôi lựa chọn giấy tẩm kháng sinh Ampicillin (10µg) làm đối chứng cho thí nghiệm đối với vi khuẩn Staphylococcus spp.
Bảng 4.6. Khả năng ức chế in vitro của cao khô dịch chiết Sài đất trong các dung môi khác nhau với vi khuẩn Staphylococcus spp.
STT Dung môi Đường kính vòng vô khuẩn (mm) D1 D2 D3 Dtb ± s 1 Đ/c DMSO 0 0 0 0 2 Ampicillin 23 23 22 22,67 ± 0,67 3 Nước cất 0 0 0 0 4 Acid acetic 5% 16 16 17 16,33± 0,67 Ethanol 35% 22 23 23 22,67 ± 0,67 5 Eethanol 70% 25 24 23 24,00 ± 1,00 6 Aceton nitril 100% 22 21 20 21,00 ± 1,00
Ghi chú: D1, D2, D3: Đường kính vòng vô khuẩn của các lần thử 1,2,3; Dtb: Đường kính vòng vô khuẩn trung bình; s: Độ lệch thực nghiệm chuẩn có hiệu chỉnh.
Kết quả thử nghiệm trên vi khuẩn Staphylococcus spp. được trình bày ở bảng 4.6 cho thấy, có 4/5 loại cao khô dịch chiết Sài đất có hoạt tính ức chế vi khuẩn in vitro với đường kính vòng vô khuẩn biến đổi từ 16,33 mm (dung môi acid acetic 5%) đến 24,00 mm (dung môi ethanol 70%). Cao khô dịch chiết sử dụng dung môi nước cất không có khả năng ức chế vi khuẩn in vitro với đường kính vòng vô khuẩn 0 mm. Cao khô dịch chiết sử dụng dung môi ethanol và aceton nitril đều cho đường kính vòng vô khuẩn > 20mm đều đạt độ mẫn cảm cao đối với vi khuẩn. Các loại cao khô dịch chiết này đều có độ mẫn cảm cao hơn hoặc bằng khả năng ức chế vi khuẩn in vitro của kháng sinh ampicillin. Cao khô dịch chiết sử dụng dung môi nước cất và acid acetic 5% có khả năng ức chế vi khuẩn thấp hơn 3 cao khô dịch chiết sử dụng dung môi khác (ethanol 35%, ethanol 70% và aceton nitril) phù hợp với kết quả nghiên cứu định tính xác định một số nhóm hoạt chất hòa tan trong cao khô dịch chiết lá Sài đất bằng phương pháp hóa học. Cao khô dịch chiết sử dụng dung môi ethanol và aceton nitril cho phản ứng dương tính với 9/10 và 8/10 phản ứng định tính trong khi đó cao khô sử
dụng dung môi nước và acid acetic chỉ cho phản ứng dương tính với 5/10 và 6/10 phản ứng định tính. Kết quả đánh giá khả năng ức chế vi khuẩn được thể hiện cụ thể ở hình 4.5
Kết quả nghiên cứu của chúng tôi khá phù hợp với nghiên cứu của Phạm Thị Dung (2015) khi đánh giá khả năng ức chế vi khuẩn in vitro của cao khô dịch chiết lá cây Đơn đỏ trong các dung môi khác nhau đối với vi khuẩn Staphylococcus aureus phân lập từ dịch viêm tử cung chó. Kết quả nghiên cứu này cho thấy ở nồng độ100 mg/ml cao khô dịch chiết cho kết quả đường kính vòng vô khuẩn khác nhau phụ thuộc vào dung môi sử dụng (DC Chloroform (17,67 ± 1,00 mm); DC Aceton (21,67 ± 1,00 mm), DC Ethanol (23,33 ± 1,00 mm), DC Methanol (24,00 ± 1,73 mm), DC Acetic acid (37,33 ± 1,00 mm)). Cao khô dịch chiết sử dụng dung môi nước không cho khả năng ức chế vi khuẩn in vitro. Tuy nhiên trong nghiên cứu này lại cho thấy dịch chiết sử dụng dung môi acid acetic cho khả năng ức chế vi khuẩn in vitro tốt nhất.