- Khảo sát tỷ lệ bò mắc bệnh viêm tử cung: Tiến hành kiểm tra tỷ lệ bò sữa bị viêm tử cung tại 03 xã thuộc huyện Vĩnh Tường tỉnh Vĩnh Phúc .
- Lấy mẫu dịch viêm tử cung bò: Tiến hành lấy mẫu dịch viêm tử cung bò trên đàn bò sữa được nuôi tại các nông hộ thuộc 03 xã thuộc huyện Vĩnh Tường tỉnh Vĩnh Phúc. Chuyển các mẫu sữa về phòng thí nghiệm của Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam.
- Xác định vi khuẩn gây bệnh viêm tử cung bò bằng phương pháp phân lập vi khuẩn: Vi khuẩn gây bệnh viêm tử cung được phân lập theo phương pháp thường qui (Nguyễn Như Thanh và cs., 2001). Nuôi cấy các dịch cần chẩn đoán vào các môi trường thông thường và môi trường đặc biệt để xác định các đặc tính nuôi cấy, đặc tính sinh vật, hoá học của từng loại vi khuẩn. Đối chứng là những mẫu dịch tử cung của bò khoẻ mạnh, bình thường trong cùng đàn.
Phương pháp pha dịch chiết nồng độ 100mg/ml: Lấy 1g cao cô toàn phần pha với 10ml Dimethyl sulfoxide (DMSO), dùng đũa thủy tinh khuấy tan hoàn toàn ta được dung dịch có nồng độ 100mg/ml.
Nuôi cấy vi khuẩn Staphylococus aureus. và Streptococus spp. trên môi trường rắn và lỏng: Vi khuẩn được cấy vạch trong môi trường LB đặc, trên đĩa petri ủ 370C/24 giờ, chọn khuẩn lạc đơn điển hình. Khuẩn lạc đơn được nuôi cấy trong bình tam giác với môi trường LB lỏng, ủ ở 370C, với tốc độ lắc 200 vòng/phút trong 12 - 14h; thu dịch khuẩn (mật độ vi khuẩn phải đạt 108 tế bào/ml là đạt chuẩn).
Xác định mật độ vi khuẩn:Mật độ vi khuẩn sau khi nuôi cấy trong môi trường LB lỏng được xác định theo phương pháp đo mật độ quang ở λ= 600nm.
+ Kiểm tra tác dụng diệt khuẩn của các dịch chiết bằng phương pháp kháng sinh đồ khuếch tán trên đĩa thạch của Kirby-Bauer.
đạt 108 tế bào/ml, lắc đều bình chứa vi khuẩn, dùng pipetman hút 100µl canh khuẩn nhỏ vào giữa đĩa thạch, dùng que thủy tinh tráng đều cho đến khi mặt thạch khô. Sau 15 phút đục lỗ trên mặt thạch với đường kính 6mm/lỗ, đục cách nhau khoảng 30mm. Mỗi lỗ thạch, nhỏ 100µl dịch chiết, đặt đĩa vào tủ ấm ở 370C/24 giờ đọc kết quả bằng cách đo đường kính vòng vô khuẩn, rồi tính số bình quân.
Phương pháp pha loãng các nồng động cao: Chuẩn bị sẵn 10 ống nghiệm sạch, vô trùng, cho vào mỗi ống 5 ml DMSO, đánh số thứ tự từ 1 đến 10. Ống nghiệm 1, được cho thêm 5ml dung dịch cao lỏng nồng độ 100mg/ml.Trộn đều dịch chiết trong ống nghiệm 1, sau đó hút 5 ml chuyển sang ống nghiệm 2, trộn đều; chuyển tiếp 5 ml từ ống nghiệm 2 sang ống nghiệm 3, trộn đều;… đến ống nghiệm thứ 10, trộn đều và bỏ đi 5 ml.
Phương pháp định tính xác định một số nhóm hợp chất có trong dịch chiết thực vật
Định tính saponin trong thực vật: Tính tạo bọt là tính chất đặc trưng của sapon n. Chúng tô dựa vào h ện tượng tạo bọt để định tính sự có mặt của Sapon n trong dịch ch ết.
- Quan sát hiện tượng tạo bọt: Cho vào ống nghiệm lớn 5 g ọt dịch ch ết ở mỗ loạ , thêm 5ml nước. Lắc mạnh trong 5 phút. Để yên và quan sát hiện tượng tạo bọt. Nếu bọt còn bền vững sau 15 phút thì sơ bộ kết luận thực vật có chứa saponin.
Định tính flavonoid
- Phản ứng với kiềm: Nhỏ một giọt dịch chiết lên giấy lọc. Hơ khô rồi để lên miệng lọ amoniac đặc đã được mở nút, sẽ thấy màu vàng của vết dịch chiết được tăng lên. Nhỏ một giọt khác làm chứng.
- Phản ứng với FeCl3: Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịch chiết. Thêm vài giọt dung dịch FeCl3 5%. Sẽ xuất hiện tủa xanh đen.
Định tính tanin
- Tác dụng với dung dịch FeCl3 5%: Lấy 2ml dịch lọc, thêm 2 giọt dung dịch FeCl3 5% sẽ thấy kết tủa xanh đen.
- Tác dụng với dung dịch gelatin 1%: Lấy 2ml dịch lọc, thêm 5 giọt dung dịch gelatin 1% sẽ xuất hiện tủa bông trắng.
Định tính alkaloid bằng thuốc thử chung
- Tác dụng với thuốc thử Mayer (100ml nước cất, 1.36g HgCl2, 5g KI): Lấy một phần dịch chiết cho vào ống nghiệm 1ml. Nhỏ vào từng ống nghiệm 2 - 3 giọt thuốc thử Mayer, nếu có alkaloid sẽ cho tủa màu từ trắng đến vàng.
- Tác dụng với thuốc thử Bouchardat (100ml nước, 2.5g I2, 5g KI): Lấy một phần dịch chiết cho vào ống nghiệm 1ml. Nhỏ vào từng ống nghiệm 2 - 3 giọt thuốc thử Bouchardat, nếu có alkaloid sẽ cho tủa nâu đến đỏ nâu.
Định tính carotenoid: Thêm vào dịch chiết vài giọt H2SO4 đậm đặc. Nếu có carotenoid, dung dịch có màu xanh dương.
Định tính polyphenol: Cho vào mỗi ống nghiệm 1 mẫu cao khô mỗi loại dịch chiết, thêm 2ml nước cất và hòa tan đều. Nhỏ vào mỗi ống 1ml FeCl3 2%, lắc đều. Dung dịch chuyển sang màu xanh đen chứng tỏ có Polyphenol.
Định tính đường khử: Cho vào mỗi ống nghiệm một ít cao khô mỗi loại dịch chiết. Cho 2 ml nước cất vào mỗi ống, hòa tan, lắc đều. Nhỏ 2 - 3 giọt thuốc thử Fehling vào mỗi ống, nếu có kết tủa đỏ gạch chứng tỏ có đường khử.
Định tính chất nhầy: Tác dụng với chì acetat 10%: lấy 2ml dịch lọc, thêm 2 giọt chì acetat 10% sẽ xuất hiện tủa bông.
Định tính coumarin : Dựa vào độ tan khác nhau khi đóng và mở vòng
lacton: cho vào ống nghiệm mỗi ống 1 - 2 ml dịch chiết. Ống thứ nhất cho thêm 0.5 ml NaOH 10%, đun cách thủy cả 2 ống (ống có coumarin thường có màu vàng xuất hiện). Để nguội, thêm vào mỗi ống 4ml nước cất. Nếu ống 1 đục hơn ống 2 nhưng sau đó acid hóa mà độ đục hoặc kết tủa như ống 2 thì sơ bộ xác định có coumarin.
Phương pháp đánh giá khả năng kháng khuẩn in vitro của nano bạc
đối với vi khuẩn
Nồng độ dung dịch nano đem cấy trộn là 100 ppm (nồng độ gốc).
Pha loãng nano theo dãy pha loãng như đã nêu ở trên (sử dụng nước đề ion để pha loãng nano), bổ sung vào mỗi ống 10 µl dịch khuẩn. Sau đó, cấy chang trên bề mặt đĩa thạch để quan sát khả năng ức chế vi khuẩn.
Nuôi tủ ấm 370/24 giờ, lấy ra đọc kết quả: Xác định nồng độ nano pha loãng thấp nhất còn có khả năng ức chế vi khuẩn.
Phương pháp đánh giá khả năng kháng khuẩn in vitro của dịch chiết thực vật khi phối trộn với nano bạc
Phối trộn dịch chiết với nano bạc: Hút 5ml dịch chiết thực vật được tách chiết, ở các nồng độ pha loãng khác nhau cho vào các ống nghiệm, tiếp tục hút 5ml nano bạc ở nồng độ ức chế tối thiểu cho lần lượt vào các ống nghiệm này, lắc đều. Hút 100µl hỗn hợp dịch chiết thực vật và nano bạc nhỏ lên các lỗ thạch trong đĩa môi trường đã được chang khuẩn. Sau đó nuôi ủ ở điều kiện 370C, sau 24h lấy ra đo đường kính vòng vô khuẩn, đánh giá khả năng kháng khuẩn của hỗn hợp dịch chiết thực vật và nano bạc dựa vào đường kính vòng vô khuẩn.
Phương pháp điều trị thử nghiệm: Sử dụng phác đồ điều trị như sau:
* Phác đồ 1: Thụt rửa tử cung bằng dung dịch Rivanol 0,1% ngày 1 lần, sau khi thụt rửa kích thích cho dung dịch thụt rửa chảy hết ra ngoài, dùng Norfloxacin 5mg/kg thể trọng pha với 100ml nước cất bơm vào tử cung; kết hợp điều trị toàn thân bằng ADE, B.complex. Liệu trình điều trị không quá 5 ngày.
* Phác đồ 2: Thụt rửa tử cung bằng dung dịch Rivanol 0,1% ngày 1 lần, sau khi thụt rửa kích thích cho dung dịch thụt rửa chảy hết ra ngoài, dùng cao khô dịch chiết Sài đất 10 mg/kg thể trọng pha với 100ml nước cất bơm vào tử cung; kết hợp điều trị toàn thân bằng ADE, B.complex. Liệu trình điều trị không quá 5 ngày.
* Phác đồ 3: Thụt rửa tử cung bằng dung dịch Rivanol 0,1% ngày 1 lần, sau khi thụt rửa kích thích cho dung dịch thụt rửa chảy hết ra ngoài, dùng cao khô dịch chiết Sài đất 10 mg/kg thể trọng pha với 100ml nước cất và bổ sung nano bạc đến nồng độ 25 ppm bơm vào tử cung; kết hợp điều trị toàn thân bằng ADE, B.complex. Liệu trình điều trị không quá 5 ngày.
Phương pháp xử lý số liệu
Các thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên và được lặp lại 3 lần. Số liệu thu được xử lý thống kê sinh học bằng phần mềm Excel 2007.
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. KHẢO SÁT BỆNH VIÊM TỬ CUNG TRÊN BÒ SỮA Ở MỘT SỐ ĐỊA PHƯƠNG THUỘC HUYỆN VĨNH TƯỜNG TỈNH VĨNH PHÚC
Với mục đích đánh giá hiện trạng bệnh viêm tử cung sau đẻ của đàn bò sữa nuôi tại một số địa phương thuộc huyện Vĩnh Tường tỉnh Vĩnh Phúc. Bằng phương pháp phỏng vấn trực tiếp người chăn nuôi kết hợp với việc thăm khám trực tiếp và sử dụng phương pháp Whiteside test (Bhat et al., 2014) để kiểm tra mẫu dịch lấy từ bò bị viêm tử cung hay bò không bị viêm tử cung chúng tôi thu được kết quả đánh giá về tỷ lệ mắc bệnh viêm tử cung trên bò sữa. Kết quả được trình bày tại bảng 4.1 và thể hiện trên biểu đồ 4.1.
Bảng 4.1. Tỷ lệ bò sữa mắc bệnh viêm tử cung ở một số địa phương thuộc huyện Vĩnh Tường, tỉnh Vĩnh Phúc
Địa điểm
Số lượng bò theo dõi (Centers for Disease Control and Prevention)
Số bò bị viêm tử cung Số lượng (n) Tỷ lệ (%) Vĩnh Thịnh An Tường 156 120 35 38 22,43 28,33 Vĩnh Ninh 115 21 18,26 Tổng số 401 94 23,44
Hình 4.1. Biểu đồ tỷ lệ bò sữa mắc bệnh viêm tử cung ở một số địa phương thuộc huyện Vĩnh Tường tỉnh Vĩnh Phúc
Kết quả nghiên cứu cho thấy, trong 401 bò sữa nuôi tại 03 xã thuộc huyện Vĩnh Tường Vĩnh phúc có 94 bò bị viêm tử cung sau đẻ, chiếm tỉ lệ 23,44%. (bảng 4.1, biểu đồ 4.1). Tỷ lệ bò mắc bệnh viêm tử cung tại các xã có sự chênh lệch cao biến đổi từ 18,26% đến 28,33%. Tuy nhiên khi xét về tỷ lệ mắc bệnh bình quân thì kết quả nghiên cứu của chúng tôi không sai khác nhiều so với các công bố trước đây. Tỷ lệ mắc bệnh viêm tử cung trên đàn bò sữa sau đẻ là khá cao tùy thuộc vào từng địa phương: 21,32% tại Hà Nội và Bắc Ninh (Nguyễn Văn Thanh và Lê Trần Tiến, 2007), 13,91% tại Nghệ An; 22,88% tại khu vực đồng bằng sông Hồng (Phạm Trung Kiên, 2012).
Trên bình diện quốc tế theo nghiên cứu của Dubuc et al. (2011) nghiên cứu trên 1295 bò sữa Holstein Friesian tại Canada, cho biết tỉ lệ mắc bệnh viêm tử cung là 17,6%. Sự sai khác ở các địa điểm theo dõi khác nhau (ở các xã khác nhau cho tỷ lệ viêm tử cung khác nhau khá phù hợp với nghiên cứu của Overton and Fetrow (2008). khi thấy rằngtỉ lệ mắc viêm tử cung ở bò sữa trung bình vào khoảng 10%, nhưng ở một số trang trại tỉ lệ này có thể cao tới 20-30%.
4.2. KẾT QUẢ PHÂN LẬP VÀ GIÁM ĐỊNH THÀNH PHẦN VI KHUẨN TRONG DỊCH TỬ CUNG CỦA BÒ SỮA TRONG DỊCH TỬ CUNG CỦA BÒ SỮA
Với mục đích tìm hiểu về tình trạng nhiễm khuẩn trong bệnh viêm tử cung, chúng tôi đã tiến hành lấy mẫu (3 - 5 ml/mẫu) dịch tử cung âm đạo của bò bình thường sau đẻ 12 - 24 giờ và lấy mẫu (3 - 5 ml/mẫu) dịch tử cung âm đạo của bò bị viêm để xét nghiệm các vi khuẩn thường gặp trong tử cung bò và tình trạng bội nhiễm của nó khi tử cung bị viêm.
4.2.1. Kết quả xác định sự biến đổi về tổng số vi khuẩn hiếu khí có trong dịch tử cung của bò sữa dịch tử cung của bò sữa
Kết quả xác định sự biến đổi về tổng số vi khuẩn hiếu khí có trong dịch tử cung của bò sữa được thể hiện thông qua Bảng 4.2.
Qua bảng số liệu cho thấy, tổng số vi khuẩn hiếu khí trong dịch tử cung của bò bị viêm tử cung và không bị viêm tử cung là khác nhau rõ rệt (P<0,001).
Kết quả nghiên cứu cho thấy trong dịch của bò không viêm cũng tồn tại vi khuẩn hiếu khí. Kết quả này phù hợp với nhận định của Pulfer and Riese (1991) khi cho rằng việc các vi khuẩn xuất hiện trong tử cung của bò sau khi đẻ không nhất thiết phải được coi là bất bình thường. Theo các nghiên cứu nhận thấy 95% vi khuẩn có thể có mặt trong môi trường tử cung của bò sau khi đẻ (Sheldon and Dobson, 2004), nhưng điều đó không đồng nghĩa với việc tử cung bị viêm vì
thực tế tỉ lệ bò bị viêm tử cung sau đẻ được công bố là nhỏ hơn rất nhiều so với tỉ lệ bò có chứa vi khuẩn trong tử cung sau khi đẻ (Overton and Fetrow, 2008). Số lượng của vi khuẩn sẽ giảm nhanh sau khi đẻ, và thông thường thì sau 3-4 tuần sau đẻ, vi khuẩn sẽ được loại bỏ hết khỏi môi trường tử cung của bò, hoặc chỉ xuất hiện với một số lượng rất thấp. Chỉ khi nào việc loại bỏ vi khuẩn ra khỏi tử cung bị trở ngại, số lượng của chúng tăng lên nhiều lần thì viêm tử cung mới xảy ra. Điều này phù hợp với kết quả nghiên cứu của chúng tôi khi mà số lượng vi khuẩn trong dịch tử cung bị viêm tăng lên gấp nhiều lần số lượng vi khuẩn có trong dịch tử cung của bò không bị viêm.
Bảng 4.2. Tổng số vi khuẩn hiếu khí có trong dịch tử cung của bò
Địa điểm
mẫu Loại mẫu
Số lượng mẫu
Tổng số (CFU/ml) (X ± SD)
Vĩnh Thịnh Dịch tử cung của bò không bị viêm 5 (6,53 ± 2,95)x10
6
Dịch tử cung của bò bị viêm 5 (7,17 ± 2,75)x108
An Tường Dịch tử cung của bò không bị viêm 5 (6,85 ± 2,87)x10
6
Dịch tử cung của bò bị viêm 5 (8,79 ± 2,89)x108
Vĩnh Ninh Dịch tử cung của bò không bị viêm 5 (5,99 ± 2,90)x10
6
Dịch tử cung của bò bị viêm 5 (7,36 ± 2,12)x108
Tổng số vi khuẩn hiếu khi trong dịch tử cung của bò không bị viêm (6,46±2,95)x106 Tổng số vi khuẩn hiếu khí trong dịch tử cung của bò bị viêm (7,77±2,71)x108
Tổng số vi khuẩn hiếu khí có trong dịch viêm tử cung tăng lên gấp 120,34 lần so với trong dịch tử cung của bò sữa không bị viêm (7,77±2,71)x108 so (6,46±2,95)x106CFU/ml]. Kết quả này phù hợp với nhận định của nhiều nghiên cứu trước đây đều cho thấy khi âm đạo và tử cung bị viêm thì số lượng vi khuẩn trong dịch viêm tăng lên gấp nhiều lần so với trong dịch tử cung sau đẻ ở bò không bị viêm, thể hiện quá trình nhiễm trùng bội nhiễm (Nguyễn Văn Thanh và Lê Trần Tiến, 2007).
Kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với nghiên cứu của (Nguyễn Văn Thanh và Nguyễn Thanh Hải, 2016) khi nghiên cứu về tổng số vi khuẩn hiếu khí trong dịch tử cung bò. Kết quả nghiên cứu này cho thấy khi bò bị viêm tử cung thì tổng số vi khuẩn hiếu khi tăng lên rất mạnh (113,24 lần) so với đối chứng.
4.2.2. Kết quả xác định sự biến đổi về thành phần vi khuẩn hiếu khí có trong dịch viêm tử cung của bò sữa dịch viêm tử cung của bò sữa
Nhằm tìm hiểu sâu hơn nữa về thành phần các vi khuẩn có trong dịch tử cung bò bị viêm cũng như bò không bị viêm để tiến hành các bước nghiên cứu tiếp theo. Các mẫu bệnh phẩm được tiến hành phân tích để tìm ra sự có mặt của các loại vi khuẩn trong dịch tử cung, từ đó thấy được sự biến đổi về thành phần của các vi khuẩn trong tử cung của bò bị viêm và không bị viêm tử cung. Kết quả của phân tích được thể hiện ở bảng 4.3.
Bảng 4.3. Tần suất xuất hiện của một số vi khuẩn hiếu khí trong dịch tử cung
VK Dịch tử cung của bò không
bị viêm tử cung Dịch tử cung của bò bị viêm tử cung E. coli 0 % (0/9) 0 % (0/9) Salmonella 0 % (0/9) 0 % (0/9) Staphylococcus spp 22,22 % (3/9) 100 % (9/9) Streptococcus spp 11,11 % (1/9) 100 % (9/9)
Kết quả cho thấy, tất cả các mẫu dịch tử cung ở bò không bị viêm tử cung và bò bị viêm viêm tử cung đều không có E. coli và Salmonella. Đối với dịch tử cung của bò không bị viêm, tỷ lệ mẫu phát hiện thấy Staphylococcus và