Ngoài ra, hệ thống chai lăn cũng được áp dụng vào nuôi cấy tế bào, tế bào được nuôi trong chai dạng hình trụ của chai lăn, kết hợp với quy trình nuôi cấy xoay liên tục, tế bào nhân lên và pháp triển quanh thành chai cung cấp được một lượng lớn tế bào. Ở hệ thống lăn này, ưu điểm là thu được một lượng tế bào cao hơn so với hệ thống chai phẳng, hệ thống lăn có thể soi dưới kinh hiển vi soi ngược. Nhược điểm của hệ thống này là tốn nhiều diện tích trong tủ ấm, chi phí hệ thống cao hơn chai phẳng và phù hợp hơn với tế bào bám dính.
Hình 2.6. Hệ thống nuôi chai lăn 2.5.2. Hệ thống Microcarrier
Microcarrier là hệ thống nuôi cấy tế bào động, có cấu tạo bao gồm các bộ phận máy điều khiển và bình nuôi cấy. Nuôi cấy tế bào dạng huyền phù, sử dụng các hạt mang Cytodex để tế bào bám và phát triển (J. Y. Liu, J. Hafner et al., 2004).
Đưa ra những khả năng mới cho việc nuôi cấy tế bào động vật. Các hạt mang tạo ra những bề mặt thuận lợi cho sự phát triển của các loại tế bào động vật và có thể được sử dụng trong các hệ thống nuôi cấy hỗn dịch hoặc có thể được sử dụng để tăng sản lượng của các chai nuôi cấy 1 lớp và các chai nuôi cấy nhiều lớp do sử dung hạt Cytodex làm tăng diện tích nuôi cấy, mỗi gram hạt có diện tích bề mặt 4400 cm2, sử dụng 3-5 g cho 1 lít môi trường nuôi cấy, lượng tế bào đưa vào nuôi cấy 2-5x105
tế bào/ml. Các ứng dụng gồm việc sản xuất số lượng lớn tế bào, virus và các sản phẩm của tế bào (như Interferon, enzym, nucleic acids, hormon) (A Ryan Ryan 2005).
Ưu điểm của hệ thống này là sản xuất được một lượng tế bào và nguyên dịch virus, chi phí vật liệu nuôi cấy thấp, hệ thống tự động điều khuyển các yếu tố pH, DO, lưu lượng khí thích hợp theo từng loại tế bào, thao tác và quá trình thực hiện theo hệ thống kín, thao tác đơn giản nên nguy cơ tạp trùng thấp, hiệu giá virus ổn định theo lô mẻ. Nhược điểm: chi phí máy đầu vào cao, không nhìn rõ hình thái tế bào và bệnh tích tế bào dưới kính hiển vi soi ngược. Tốn nhiều công sức tìm được các điều kiện tối ưu ban đầu cho từng loại tế bào.
2.5.3. Máy điều khiển
Điều chỉnh chế độ khí phụ thuộc vào độ pH và DO trong dịch nuôi, điều khiển nhiệt độ trong dịch nuôi và nhiệt độ lớp dung dịch bảo ôn, điều khiển tốc độ của cánh khuấy, lưu lượng của bơm nhu động phục vụ cho qui trình thay môi trường (Kjell Nilsson 1988).
2.5.4. Bình nuôi cấy
Dung tích 10 lít có gắn bên trong các sensor pH, sensor DO, sensor nhiệt độ, trục khuấy được kết hợp với bộ phận sục khí từ dưới đáy bình có tác dụng khuấy trộn môi trường. Bộ phận màng được gắn vào trục có tác dụng giảm lực tác động lên tế bào khi trục khuấy quay và làm nhỏ bóng khí khi đi qua màng từ đó sự hòa trộn của dòng khí vào trong pha lỏng hiệu quả hơn do sự lưu trú các bong bóng khí trong môi trường (Kjell Nilsson, 1988).
2.5.5. Hạt Cytodex
Hạt Cytodex là các hạt mang dùng cho nuôi cấy tế bào. Nuôi cấy mang là một công nghệ nuôi cấy có thể cho sản lượng cao. Cytodex được sản xuất bởi Pharmacia, dùng cho nuôi cấy các loại tế bào động vật, với thể tích từ vài lít đến trên 1000 lít. Sử dụng cytodex trong hệ thống nuôi cấy hỗn dịch cung cấp sản lượng
hàng vài triệu tế bào trên 1ml (GE Healthcare and Amersham Biosciences, 2005). Cytodex đưa ra những khả năng mới cho việc nuôi cấy tế bào động vật. Các hạt mang tạo ra những bề mặt thuận lợi cho sự phát triển của các loại tế bào động vật và có thể được sử dụng trong các hệ thống nuôi cấy hỗn dịch hoặc có thể được sử dụng để tăng sản lượng của các chai nuôi cấy 1 lớp và các chai nuôi cấy nhiều lớp. Các ứng dụng gồm việc sản xuất số lượng lớn tế bào, virus và các sản phẩm của tế bào ( như Interferon, enzym, nucleic acids, hormon). Các nghiên cứu về độ bám của tế bào, các hệ thống nuôi cấy cột dung hợp, các nghiên cứu trên kính hiển vi, tách tế bào, các nghiên cứu về màng tế bào, bảo quản và vận chuyển tế bào (GE Healthcare and Amersham Biosciences 2005)
Cytodex được thiết kế để đáp ứng những yêu cầu đặc biệt về công nghệ nuôi cấy mang dạng quay. Hạt Cytodex có tính trơ sinh học và là 1 cơ chất khỏe nhưng không cứng, phù hợp cho nuôi cấy mang quay, có độ trong cho phép dễ dàng kiểm tra độ bám dính của các tế bào dưới kính hiển vi.
Cytodex được sản xuất dựa trên cơ chế tích điện với các nhóm N- diethylaminoethyl tích điện (+), các nhóm này được phân bố trên toàn hạt mang (Christian Kaisermayer, Ann-Christin Magnusson et al., 2013).
Ưu điểm của Microcarrier là nó cung cấp một diện tích bề mặt lớn để gắn tế bào. Vật liệu là các hạt nhựa tổng hợp trao đổi ion, các hạt dựa trên cơ sở dextran được bọc bằng gelatin, các hạt polyacrylamide, các hạt cellulose.. được ổn định bằng polylysine (Colin Ratledge and Bjorn Kristiansen, 2006).
2.5.6. Các loại hạt Cytodex
Cytodex 1 : Phù hợp cho các mục đích chung về nuôi cấy mang. Đặc biệt cho hầu hết các dòng tế bào thường trực. Hạt mang này có thể được sử dụng cho nuôi cấy tế bào tiên phát và các dòng tế bào diploid khi sự phục hồi tối đa các sản phẩm nuôi cấy là không cần thiết (Enda Moran, 1999).
Cytodex 2: Sử dụng cho nuôi cấy khi mục đích là việc nuôi cấy virut hoặc là các sản phẩm tế bào. Khi phục hồi tối đa các sản phẩm nuôi cấy là cần thiết hoặc khi cần phải dễ dàng loại bỏ các thành phần của môi trường thì cytodex 2 là hạt mang phù hợp nhất. Hạt mang này đã được sản xuất chuyên biệt cho nuôi cấy tế bào tiên phát và các dòng tế bào diploid và cho kết quả tốt nhất đối với nuôi cấy các tế bào hình sợi (Enda Moran, 1999).
PHẦN 3. VẬT LIỆU- PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
3.1.1. Nghiên cứu quy trình nuôi cấy tế bào Marc-145 trên hệ thống Microcarrier
- Xác định tốc độ khuấy thích hợp để nuôi tế bào Marc-145 trên hệ thống Microcarrier.
- Xác định giá trị DO thích hợp để nuôi cấy tế bào Marc-145 trên hệ thống Microcarrier.
- Xác định lưu lượng khí cấp vào thích hợp để nuôi cấy tế bào Marc-145 trên hệ thống Microcarrier.
- Xác định lượng tế bào Marc-145 cấy vào hạt Cytodex trên hệ thống Microcarrier.
- Xác định môi trường nuôi cấy thích hợp cho tế bào Marc-145 trên hệ thống Microcarrier.
3.1.2. Nghiên cứu tính thích ứng của virus Tai Xanh nuôi cấy trên tế bào Marc-145 bằng hệ thống Microcarrier Marc-145 bằng hệ thống Microcarrier
- Xác định thời gian hấp phụ virus vào tế bào, xử lí dịch ủ virus. - Xác định môi trường duy trì sau gây nhiễm virus.
- Xác định liều gây nhiễm, thời gian thu hoạch thích hợp trên hệ thống Microcarrier.
3.1.3. Nghiên cứu quy trình thu hoạch và xử lí dịch virus sau khi thu hoạch 3.2. ĐỐI TƢỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 3.2. ĐỐI TƢỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
3.2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
- Tế bào Marc-145 đang dùng sản xuất (working cell bank) giữ giống tại công ty Hanvet
- Giống virus nhược độc PRRS Hanvet1.vn đang dùng sản xuất (Product Seed).
3.2.2. Vật liệu nghiên cứu
Thiết bị Dụng cụ
- Hệ thống Microcarrier - Tủ ấm CO2, tủ ấm thường - Máy bơm chân không - Máy khuấy từ - Máy đo pH - Cân phân tích - Cân điện tử - Tủ lạnh 2-8˚C - Tủ lạnh -40˚C , -80˚C
- Box cấy an toàn sinh học cấp 2 - Kính hiển vi soi ngược
- Hạt Cytodex-1
- Đĩa 96 giếng đáy chữ U - Ống falcon 15ml, 50ml
- Chai schott 500ml, 1 lít, 2 lít, 5 lít, 10 lít. - Pipet aid
- Pipet man: 200µl, 1ml, 8 kênh, 12 kênh - Pippet thủy tinh10ml, 20ml
- Đầu tuýp 200µl, 1ml, 5ml - Giấy chỉ thị nhiệt
- Găng tay y tế
- Giá để ống, khay nhôm, rổ nhựa.
Hóa chất:
- Môi trường nuôi cấy tế bào: MEM, DMEM, M199, LH, Hank, PBS... - Hóa chất, huyết thanh : FBS, Tripsin-EDTA, Hepes, Trypan blu... - Môi trường kiểm tra độ thuần khiết: thạch máu, TSB và nước thịt gan yếm khí...
3.3. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
- Phòng tế bào- trung tâm nghiên cứu- Công ty TNHH dược Hanvet- KCN phố nối A- Hưng Yên.
3.4. THỜI GIAN NGHIÊN CỨU - Từ 6/2018 đến 5/2019. - Từ 6/2018 đến 5/2019.
3.5. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.5.1. Phƣơng pháp nuôi cấy tế bào
a. Khôi phục tế bào:
- Lấy ống tế bào được bảo quản đông lạnh trong nitơ lỏng ra, rã đông nhanh chóng trong bể ổn nhiệt 37°C. Sau rã đông chuyển ống vào Laminar air flow (Laf) vô trùng, chuyển hỗn dịch tế bào vào ống ly tâm có chứa môi trường nuôi cấy đã được làm ấm của tế bào tương ứng. Ly tâm hỗn dịch tế bào trong khoảng 1500v/5-10 phút.
- Sau ly tâm loại bỏ phần dịch nổi, giữ phần tế bào lắng cặn ở dưới. Hoàn nguyên bằng môi trường nuôi tế bào. Trộn đều bằng cách dùng pipet hút nhả.
- Chuyển toàn bộ dung dịch tế bào này vào chai nuôi tế bào Tfask có môi trường nuôi dưỡng bổ sung huyết thanh và kháng sinh.
- Ủ chai nuôi cấy ở tủ ấm 37°C, 5% CO2.
- Qua 1 ngày, loại bỏ môi trường nuôi dưỡng cũ để loại bỏ DMSO, rửa lớp tế bào bằng dung dịch PBS rồi cho môi trường nuôi dưỡng mới bổ sung huyết thanh. Ủ chai nuôi tế bào ở tủ ấm 37°C, 5% CO2 để tế bào phát triển.
- Hằng ngày theo dõi sự phát triển của tế bào trên kính hiển vi quang học.
b. Tách tế bào
- Rửa chai tế bào bằng PBS(-): 1 – 2 lần. Cho TE 0,05% , láng chai Ủ 37oC, 5 – 15 phút, cho tới khi tế bào co tròn, bắt đầu bong khỏi đáy chai, vỗ nhẹ chai nuôi, trung hòa bằng môi trường 5% huyết thanh. Đếm số tế bào trên buồng đếm hồng cầu, định lượng tế bào. Tính toán và chia tế bào ra các chai nuôi ở tủ ấm 37o
C.
- Hàng ngày quan sát khả năng phát triển của tế trong các chai tế bào trên kính hiển vi quang học.
- Nhân số lượng tế bào trên các chai nuôi cấy
Để đủ số lượng tế bào Marc-145 nuôi trên hệ thống Microcarrie với dung tích 10 lít, 50g hạt Cytodex-1, tế bào Marc-145 cần phải được nhân theo từng cấp độ với quy mô lớn dần. Quy trình nhân số lượng tế bào được mô tả trong hình dưới đây:
Hình 3.1. Mô hình nhân số lƣợng tế bào cho nuôi cấy trên hệ thống Microcarrier
c. Phương pháp đếm tế bào
- Chuẩn bị buồng đếm
Dùng vải gạc sạch, tẩm cồn lau sạch buồng đếm và phiến kính đậy. Để buồng đếm và phiến kính đậy khô hoàn toàn (có thể hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn).
Đặt buồng đếm trên mặt phẳng ngang rồi đặt phiến kính đậy vào vị trí buồng đếm. Chú ý không để phiến kính đậy bị lệch, kênh.
Hình 3.2. Buồng đếm tế bào
Trên buồng đếm tế bào có 2 vùng đếm, 1 vùng ở trên và 1 vùng ở dưới. Mỗi vùng có 4 ô đếm. 1mm 1mm 1mm 1m m Vùng đếm Ô đếm Buồng đếm tế bào
Khi đếm, kết quả đếm được tính trên cả 2 vùng đếm bao gồm 8 ô đếm.
- Trong mỗi ô đếm, thứ tự đếm được mô tả như trên hình vẽ.
Tiến hành đếm số lượng tế bào
Dùng pipetman hút lên nhả xuống 5 lần hỗn dịch tế bào và thuốc nhuộm rồi hút một lượng nhỏ hỗn dịch tế bào.
Đưa đầu típ vào vị trí cạnh của phiến kính đậy rồi bơm thật nhẹ hỗn dịch tế bào trong đầu típ ra để hỗn dịch tế bào đi vào buồng đếm bằng lực mao dẫn đến khi hỗn dịch tế bào phủ một lớp mỏng kín buồng đếm là được.
Đếm số lượng tế bào bằng kính hiển vị với vật kính 10x. Tiến hành đếm trên cả 2 buồng đếm, mỗi buồng đếm 4 ô vuông 1mm2 (Đếm các tế bào trên các ô đánh số 1)
Chỉ đếm những tế bào sống: là những điểm tròn, sáng trên nền xanh. Đếm các tế bào trong mỗi ô đếm 1mm2
theo hình zic-zắc từ trái qua phải, từ trên xuống dưới.
Các tế bào nằm giữa các cạnh của ô đếm thì chỉ đếm những tế bào nằm giữa cạnh phía trên và cạnh bên trái, không đếm tế bào nằm trên cạnh phía đưới và cạnh bên phải.
Để đảm bảo độ chính xác, số lượng tế bào đếm được ở mỗi ô đếm nên giới hạn trong khoảng 20 -50 tế bào. Nếu số lượng tế bào đếm được trong mỗi ô đếm ít hơn 20 hoặc nhiều hơn 50 cần tiến hành đếm lại với độ pha loãng thích hợp.
Nếu hơn 10% tế bào bám thành cụm phải làm lại từ đầu và bảo đảm các tế bào đã tách riêng rẽ.
Công thức :
C: Hệ số pha loãng tế bào
A: Số tế bào đếm lần 1
B: Số tế bào đếm lần 2
16 : Số ô đếm của 2 buồng (8 ô 2 buồng đếm)
104 : Nghịch đảo thể tích dịch trong 1 ô đếm
d. Phương pháp nuôi cấy tế bào trên hạt nang Cytodex bằng hệ thống Microcarrier.
Chuẩn bị hạt Cytodex:
- Cân Cytodex-1 vào một chai schott hoặc bình tam giác có nắp, rửa hạt Cytodex 1-2 lần bằng PBS(-), láng đều 10 – 15 lần, để lắng, bỏ nước nổi. Sau khi rửa bổ sung PBS(-), đóng nắp, sấy vô trùng 121˚C/30 phút. Bảo quản ở nhiệt độ 2-8˚C
- Sau khi sấy hạt Cytodex, để lắng hạt đổ bỏ dịch trong, bổ sung thêm môi trường nuôi cấy + huyết thanh để loại bỏ PBS(-), để lắng đổ bỏ môi trường. Bổ sung thêm môi trường nuôi cấy + huyết thanh để loại bỏ PBS(-) , lắc đều.
(chú ý: tất cả thao tác đều được làm trong lab, thao tác vô trùng)
Nuôi cấy tế bào Marc-145 trên hệ thống Microcarrier
Hệ thống sau khi được xử lý vô trùng và lắp đặt xong tiến hành chuyển tế bào Marc và hạt cytodex-1 vào hệ thống. Quy trình thực hiện như sau:
Hạt Cytodex sau khi hấp vô trùng chuyển vào Lab vô trùng tiến hành loại bỏ PBS(-). Bổ sung 500ml môi trường nuôi cấy có bổ sung kháng sinh lắc nhẹ để hạt lắng ở nhiệt độ phòng
Hút loại bỏ môi trường, bổ sung 500ml môi trường nuôi cấy + huyết thanh lắc nhẹ để lắng ở nhiệt độ 37ºC (khoảng 30 – 45 phút).
Hút loại bỏ môi trường, bổ sung lượng tế bào Marc-145 đã chuẩn bị vào chai có chứa hạt Cytodex. Sử dụng chai chia 1 lít để chuyển hỗn hợp tế bào và hạt cytodex vào trong bình nuôi của hệ thống Microcarrier. Bổ sung môi trường nuôi cấy theo các công thức đã thiết kế với nồng độ huyết thanh khác nhau vào nuôi tế bào
Kết nối bình nuôi sau khi sấy vào bộ điều khiển, bơm toàn bộ dịch trong bình nuôi ra ngoài, kết nối bình nuôi với chai chứa hạt cytodex, và chai chứa hỗn dịch tế bào. Bơm toàn bộ lượng hạt vào trong bình nuôi sau đó bơm toàn bộ hỗn dịch tế bào vào trong bình nuôi, bật cánh khuấy của hệ thống bình nuôi. Kiểm tra lượng hỗn dịch có trong bình nuôi, kết nối chai môi trường bơm vào bình nuôi cho đủ 500ml. Bật hệ thống khí chế độ tự động (tự động chọn loại khí sục vào bình nuôi). kết nối hệ thống để cân chỉnh điện cực DO và pH, để đảm bảo các điện cực hoạt động tốt, hiển thị chính xác các thông số đo (Kjell Nilsson 1988).
1. Kiểm tra đảm bảo điện cực pH đã được nối đúng với bộ điều khiển. 2. Cắm điện và bật công tắc nguồn hệ
thống nuôi cấy tế bào .