Giá trị DO
(%)
Số lƣợng tế bào vào
(x106)
Số lƣợng tế bào sau 72h nuôi (x106) Tỉ suất (lần) 20 750 ±30 9497 ±47 12,6 ±0,63 30 750 ±30 9957 ±63 13,2 ±0,84 40 750 ±30 15283 ±53 20,4 ±0,70 50 750 ±30 16653 ±30 22,2 ±0,41
Ghi chú: DO- Dissolved Oxygen: Nồng độ oxi hòa tan
Chúng tôi thu được kết quả đếm số năng suất sinh sản tế bào Marc-145 bảng 4.3. Nuôi cấy tế bào ban đầu cố định 750x106 tế bào/bình ở các giá trị DO khác nhau cho năng suất sinh sản tế bào khác nhau. Giá trị DO=20-30% năng suất nhân tế bào gấp 12-13 lần so với tế bào đầu vào. Giá trị DO= 40% năng suất nhân lên hơn 20 lần so với tế bào đầu vào. Ở giá trị DO= 50% năng suất của tế bào đạt cao nhất hơn 22 lần.
Kết quả đếm số phù hợp với mức độ bám, phát triển của tế bào trên hạt Cytodex ở từng giá trị DO được trình bày ở bảng 4.2. Tuy nhiên, năng suất sinh sản tế bào Marc-145 trên hệ thống Microcarrier chưa đạt được năng suất sinh sản
cao nhất trên hệ thống chai Tfask đang sản xuất. Các thí nghiệm tiếp theo, chúng tôi tiến hành tối ưu các yếu tố khác để thu được năng suất sinh sản tế bào Marc-145 cao nhất.
Từ kết quả thí nghiệm trên, giá trị DO= 50% đang cho tế bào Marc-145 phát triển tốt nhất, năng suất sinh sản cao nhất, nên lựa chọn cài đặt hệ thống DO=50% cho các thí nghiệm tiếp theo.
4.1.3. Xác định lƣu lƣợng khí cấp vào thích hợp để nuôi cấy tế bào Marc- 145 trên hệ thống Microcarrier
Sau khi đã xác định được tốc độ khuấy và nồng độ oxi hòa tan- DO thích hợp nuôi tế bào Marc-145 trên hệ thống Microcarrier. Chúng tôi tiến hành xác định lưu lượng khí cấp vào để nuôi cấy tế bào Marc-145. Lưu lượng khí được thiết kế cấp vào hệ thống Microcarrier khoảng 0,2-1,0 lít/phút. Để xác định lưu lượng khí cấp vào chúng tôi sử dụng khí trộn của 4 loại khí: N2, O2, CO2 và không khí. Tiến hành thí nghiệm với 4 lưu lượng khí lần lượt là 0,25 lít/phút; 0,5 lít/phút; 0,75 lít/phút, 1,0 lít/phút. Đồng thời, tiến hành xác định thêm thời gian máy điều khiển lưu lượng khí để điều chính các thông số pH và DO ổn định. Thí nghiệm được thực hiện 3 lần, cố định các điều kiện nuôi tế bào, cài đặt hệ thống: tốc độ khuấy 60 vòng/phút; DO= 50% và pH=7,2 ±0,2.
Hệ thống khí gồm 4 khí O2, N2, CO2 và không khí, các khí tổng chia ra các dây dẫn khí đi vào từng hệ thống. Ở hệ thống sẽ cài đặt lưu lượng khí thích hợp cho việc nuôi tế bào, các khí trộn với nhau qua bình khí của hệ thống rồi đi vào bình nuôi tế bào.
Bảng 4.4. Kết quả điều chỉnh lƣu lƣợng khí cấp vào môi trƣờng nuôi Lƣu lƣợng khí (lít/phút) Tạo bọt môi trƣờng Thời gian ổn định DO, pH 0,25 Không 3 giờ 50 phút 0,5 Không 3 giờ 50 phút 0,75 Có 3 giờ 50 phút 1,0 Có 4 giờ 00 phút
Ghi chú: DO- Dissolved Oxygen: Nồng độ oxi hòa tan
Từ kết quả bảng 4.4 thu được, chúng tôi có thể nhận thấy lưu lượng khí từ 0,25 lít/phút đến 0,5 lít/phút không tạo bọt môi trường nuôi, còn lưu lượng khí từ 0,75 lít/phút trở lên tạo bọt môi trường nuôi. Các lưu lượng khí khác nhau, thời gian điều chỉnh giá trị DO và pH ổn định ở mức pH=7,2±0,2 và DO=50% đều tương đương nhau, khoảng 3 giờ 50 phút.
Từ kết quả thu được, chúng tôi lựa chọn lưu lượng khí 0,25-0,5 lít/phút cho các thí nghiệm tiếp theo.
4.1.4. Xác định môi trƣờng nuôi cấy thích hợp cho tế bào Marc-145 trên hệ thống Microcarrier
Năng suất sinh sản tế bào ảnh hưởng trực tiếp bởi môi trường nuôi không thích hợp. Để tìm ra công thức môi trường nuôi tối ưu nhất cho sự phát triển cũng như sự nhân của tế bào, tiến hành thí nghiệm nuôi cấy tế bào Marc-145 trên 4 công thức môi trường khác nhau là MEM, DMEM, M199 và LH, quá trình thực hiện cố định các thống số cài đặt hệ thống, điều kiện nuôi cấy và theo dõi các chỉ tiêu:
Khả năng bám và phát triển tế bào Marc-145 trên hạt Cytodex Năng suất sinh sản của tế bào sau 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ và 96 giờ.
Để đánh giá năng suất nhân lên của tế bào Marc-145 trên các loại môi trường khác nhau, tiến hành thí nghiệm mỗi loại môi trường một bình Microcarrier với lượng tế bào cấy vào ban đầu cố định là 750x106 tế bào, 50 gram hạt Cytodex cho bình Microcarrier 10 lít, cài đặt các thông số: tốc độ khuấy 60 vòng/phút; lưu lượng khí 0,5 lít/phút; DO=50%; pH=7,2±0,2. Thí
nghiệm được lặp lại 3 lần với các điều kiện nuôi giống nhau. Kết quả theo dõi thí nghiệm được thể hiện ở bảng 4.5:
Bảng 4.5. Khả năng bám và phát triển tế bào Marc-145 trên các loại môi trƣờng
Thời gian theo dõi Môi trƣờng
MEM DMEM M199 LH Độ bám tế bào (%) 24 20-30 10-20 20-30 10-20 48 60-70 30-40 50-60 30-40 72 90-100 70-80 90-95 70-80 96 100 90-100 100 90-100 Qua quá trình theo dõi ở cả 4 loại môi trường nuôi chúng tôi thấy rằng tất cả các môi trường MEM, DMEM, M199 và LH, tế bào Marc-145 đều có khả năng bám, nhân lên và phát triển sau 24 giờ nuôi và sau 72-96 giờ nuôi tế bào bám kín tất cả các hạt Cytodex. Tuy nhiên mức độ nhân lên và bám của tế bào khác nhau trên từng loại môi trường.
Hiện tại, hệ thống nuôi trên chai Tfask 225cm2 chúng tôi đang sử dụng môi trường MEM bổ sung 5%FBS+ kháng sinh, nuôi 72 giờ, cho năng suất nhân là 25-30 lần
Quá trình thực hiện thí nghiệm, chúng tôi tiến hành lấy mẫu theo dõi mức độ phát triển của tế bào trên kính hiển vi và đếm số tế bào sau 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ và 96 giờ nuôi. Kết quả thu được năng suất nhân của tế bào Marc-145 trên từng loại môi trường nuôi khác nhau được thể hiện hình 4.4.
Kết quả hình 4.4 cho thấy tỉ suất sinh sản tế bào Marc-145 trên tất cả môi trường nuôi tế bào đều thích ứng với tế bào Marc-145 và tế bào nhân lên sau 24 giờ nuôi,tế bào phát triển mạnh nhất trong khoảng 48 giờ- 72 giờ nuôi, sau 96 giờ nuôi tế bào không còn nhân lên và phát triển nhiều.
Môi trường MEM cho tỉ suất sinh sản tế bào cao nhất tăng 30-31 lần so với tế bào đầu vào. Môi trường M199 tỉ suất nhân 20-22 lần so với tế bào đầu vào, môi trường DMEM và LH cho tỉ suất sinh sản thấp nhất tăng 17-18 lần so với tế bào đầu vào.
Mỗi một loại tế bào khác nhau sẽ phát triển trên các công thức môi trường nuôi khác nhau , cho nên phải tìm công thức môi trường nuôi thích hợp và tối ưu nhất cho tế bào. Lựa chọn được môi trường tối ưu nhất cần đủ hai yếu tố: tốc độ phát triển và năng suất nhân lên của tế bào. Từ kết quả bảng 4.5 và hình 4.4 môi trường MEM là môi trường nuôi tế bào Marc-145 có tốc độ phát triển nhanh và mạnh nhất (sau 72 giờ nuôi tế bào bám 100%) và tỉ suất nhân lên của tế bào cao nhất (≥30 lần). Từ kết quả thí nghiệm thu được trên, chúng tôi lựa chọn môi trường MEM bổ sung 5%FBS + kháng sinh là môi trường nuôi tế bào Marc-145 trên hệ thống Microcarrier cho các thí nghiệm tiếp theo.
4.1.5. Xác định lƣợng tế bào Marc-145 cấy vào hạt Cytodex trên hệ thống Microcarrier (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Sau khi xác định được các thông số cài đặt hệ thống Microcarrier thích hợp nhất nuôi cấy tế bào Marc-145, chúng tôi tiến hành xác định mật độ đầu vào tế bào Marc-145 thích hợp trên hệ thống Microcarrier 10 lít, tiến hành thí nghiệm với mật độ tế bào ban đầu lần lượt 10x106tế bào; 15x106tế bào và 20x106 tế bào tương ứng với các khối lượng hạt Cytodex là 1,0gram; 1,5 gram; 2,0 gram. Môi trường tối ưu cho sự phát triển của tế bào Marc-145 được chọn ra từ mục 4.1.4. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần và các điều kiện nuôi cấy giống nhau.
Kết quả thu thập được thể hiện bảng 4.6:
Bảng 4.6. Số lƣợng tế bào Marc-145 nuôi sau 72 giờ và 96 giờ nuôi Số lƣợng
tế bào vào (x106)
Khối lƣợng hạt Cytodex (gram)
1,0 1,5 2,0
72h 96h 72h 96h 72h 96h
10 327,2±24 327,1±31 350,9+35 369,3±32 344,5±42 401,2±33
15 490,4±35 491,0±38 642,7±41 619,3±40 519,5±38 575,6±36
Lượng tế bào nhân lên và phát triển phụ thuộc vào mật độ tế bào cấp vào và diện tích bề mặt để tế bào phát triển. Kết quả đếm số tế bào thấy rằng cùng một lượng tế bào đầu vào và cùng số lượng hạt Cytodex nuôi 72 giờ và 96 giờ tế bào nhân lên và phát triển tương đương nhau.
Để đánh giá được số lượng tế bào nhân lên sau 72-96 giờ nuôi chúng tôi có hình biểu thị tỉ suất nhân của tế bào theo kết quả đếm số ở bảng 4.6.
Hình 4.5. Tỉ xuất nhân tế bào Marc-145 khi đầu vào tế bào khác nhau
Từ các kết quả đếm số tế bào bảng 4.6 và tỉ suất nhân tế bào Marc-145 hình 4.5, Tế bào Marc-145 đầu vào là 15x106TB/1,5 gram Cytodex cho tỉ xuất nhân tế bào là cao nhất (tăng 42 lần so với tế bào đầu vào). Kết quả phù hợp với nghiên cứu tỉ suất nhân tế bào trên hệ thống chai Tflask khi nghiên cứu về đặc tính sinh sản của tế bào Marc-145.
Dưới đây là một số hình ảnh nuôi tế bào Marc-145 trên hệ thống Microcarrier sau 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ và 96 giờ.
(1) (2)
(3) (4) Hình 4.6. Mức độ bám tế bào Marc-145 trên hạt Cytodex (1)24giờ nuôi, (2) 48 giờ nuôi. (3) 72 giờ nuôi, (4) 96 giờ nuôi
Kết quả nghiên cứu trên, lựa chọn tế bào đầu vào là 15x106TB/1,5 Gram Cytodex tương đương với 300x106TB/30gram hạt Cytodex cho hệ thống Microcarrier 10 lít. Kết quả này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của (A Ryan Ryan 2005)
4.2. NGHIÊN CỨU TÍNH THÍCH ỨNG CỦA VIRUS TAI XANH NUÔI CẤY TRÊN TẾ BÀO MARC-145 BẰNG HỆ THỐNG MICROCARRIER 4.2.1. Xác định thời gian hấp phụ virus vào tế bào, xử lí dịch hấp phụ virus
thuộc hoàn toàn vào bộ máy tổng hợp của tế bào. Muốn nhân virus lên thì virus phải được tế bào cho phép và xâm nhập vào tế bào. Sự hấp phụ virus là virus gắn vào thụ thể (receptor) đặc hiệu nằm trên màng sinh chất của tế bào chủ, sự hấp phụ xảy ra tốt nhất ở 37˚C.
Để xác định thời gian hấp phụ virus vào tế bào sao cho sự xâm nhập và nhân lên của virus cho hiệu giá virus cao nhất, thích hợp nhất chúng tôi thí nghiệm trên 4 thời gian hấp phụ virus: không hấp phụ, hấp phụ 30 phút, 60 phút và 90 phút. Ngoài ra dịch hấp phụ virus cũng được tiến hành hút sau khi hấp phụ hoặc không hút sau khi hấp phụ.
Kết quả theo dõi bệnh tích tế bào (CPE) để xác định được thời gian hấp phụ virus tối ưu nhất được trình bày bảng 4.7.
Bảng 4.7. Khả năng gây bệnh tích tế bào trong thời gian hấp phụ virus Thời Thời gian Hút dịch hấp phụ (%) Không hút dịch hấp phụ (%) 30 phút 60 phút 90 phút 0 phút 30 phút 60 phút 90 phút 24 0 0 0 0 0 0 0 36 0 0 0 0 0 0 5 48 10 10 20 10 10-20 20 20 60 30 30 50-60 30 30 50 50 72 40-50 50-60 70 50-60 60 70 70 Chú thích:
Tính theo % tế bào bong khỏi hạt Cytodex so với tổng số hạt Cytodex trên một vi trường (ước lượng bằng mặt thường khi soi trên kính hiển vi soi nổi)
Bệnh tích tế bào (CPE) xuất hiện sớm nhất ở 36 giờ sau gây nhiễm và sau 48 giờ gây nhiễm thấy rõ hơn. Tế bào có hiện tượng bong ra khỏi hạt Cytodex ra ngoài môi trường nuôi. Sau 60-72 giờ gây nhiễm tế bào bong ra khỏi hạt nhiều và có thế quan sát rõ hơn trên kính hiển vi soi nổi. Kết quả bệnh tích tế bào cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu trên chai Tflask (Nguyễn Thị Minh Hường 2015)
Ở các thời gian hấp phụ virus khác nhau đều cho bệnh tích tế bào sau 48 giờ khoảng 10-20%. Tuy nhiên, hấp phụ virus 90 phút và không hút dịch hấp phụ xuất hiện bệnh tích tế bào sớm hơn sau 36 giờ gây nhiễm bệnh tích khoảng 5%. Khoảng thời gian sau 72 giờ gây nhiễm, bệnh tích tế bào bong nhiều, môi trường giảm pH nhanh. Hấp phụ virus và không hút dịch hấp phụ bệnh tích gây bong nhiều hơn (60-70%) so với hấp phụ virus và hút dịch hấp phụ (50-60%).
Lấy mẫu xác định hiệu giá virus và thu được kết quả ở bảng 4.8:
Bảng 4.8. Kết quả hiệu giá xác định thời gian hấp phụ virus vào tế bào Thời gian Thời gian hấp phụ virus (phút) Hút dịch hấp phụ (log10 TCID50/ml) Không hút dịch hấp phụ (log10 TCID50/ml) 0 5,53 ±0,05 30 5,17±0,17 6,80 ±0,08 60 7,07 ±0,05 7,33 ±0,15 90 7,20 ±0,08 7,30 ±0,08
Từ kết quả bảng 4.8 cho thấy thời gian hấp phụ virus có ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển, nhân lên của virus cũng như mức độ biệu hiện bệnh tích tế bào, hiệu giá virus. Trong cùng thời gian hấp phụ virus nhưng ở bình hút dịch hấp phụ virus cho hiệu giá virus thấp hơn ở các bình không hút dịch hấp phụ virus từ 0,5- 1,0 log10TCID50/ml. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hút dịch hấp phụ virus: Hấp phụ 30 phút sau 72 giờ gây nhiễm bệnh tích tế bào khoảng 40-50% cho kết quả xác định hiệu giá virus thấp nhất giao động từ 4,9-5,3 log10 TCID50/ml trung bình 5,17 log10TCID50/ml. Hấp phụ 60 phút sau 72 giờ gây nhiễm, hiệu giá virus giao động từ 6,9-7,1 log10TCID50/ml, kết quả xác định hiệu giá trung bình 7,07 log10TCID50/ml. Hấp phụ 90 phút sau 72 giờ gây nhiễm, hiệu giá virus giao động từ 7,1-7,3 log10TCID50/ml. Kết quả xác định hiệu giá trung bình đang cao nhất 7,20 log10TCID50/ml.
Không hút bỏ dịch hấp phụ: không hấp phụ virus và hấp phụ virus 30 phút sau 72 giờ gây nhiễm bệnh tích tế bào khoảng 50-60% thu được kết quả hiệu giá virus thấp nhất trung bình 5,53-6,80 log10TCID50/ml và tăng 1,63 log10TCID50/ml tức tăng 42 lần so với hấp phụ 30 phút hút dịch hấp phụ. Hấp phụ 60 phút và 90 phút bệnh tích tế bào sau 72 giờ gây nhiễm khoảng 70%, kết quả xác định hiệu giá giao động 7,1-7,5log10TCID50/ml. Hiệu giá trung bình 7,3-7,33 log10TCID50/ml và tăng 1,0 log10TCID50/ml so với hút dịch hấp phụ.
Kết quả trên cho thấy rằng hiệu giá virus cao nhất là hấp phụ virus 60 phút -90 phút và không hút dịch hấp phụ. Tuy nhiên trong sản xuất quy mô công nghiệp việc rút ngắn thời gian và giảm các thao tác, tránh tạp trùng trong quá trình sản xuất là rất cần thiết.
Kết quả các lô thí nghiệm trên hệ thống Microcarrier cũng cho kết quả tương tự với các thí nghiệm trước đây trên chai Tflask đã thực hiện (7,1-7,3 log10TCID50/ml), nên kết quả càng có độ tin tưởng cao.
Qua phân tích kết quả trên, lựa chọn hấp phụ virus Tai Xanh vào tế bào Marc-145 là 60 phút, không hút bỏ dịch hấp phụ cho các thí nghiệm tiếp theo.
4.2.2. Xác định môi trƣờng duy trì sau gây nhiễm virus
Môi trường duy trì tế bào sau nhiễm là môi trường nuôi tế bào có ít hoặc không có huyết thanh động vật. Môi trường duy trì có tác dụng duy trì sự sinh trưởng ổn định của tế bào tạo điều kiện tối ưu cho quá trình xâm nhập và nhân lên của virus.
Để tìm ra loại môi trường duy trì tế bào trong quá trình gây nhiễm virus đạt hiệu giá virus cao nhất khi thu hoạch. Tiến hành thử nghiệm trên 4 công thức môi trường: MEM, DMEM, M119 và LH. Tuy nhiên, sự duy trì sinh trưởng tế bào bị ảnh hưởng bởi hàm lượng huyết thanh và pH môi trường. Tất các công thức môi