Sau quá trình thu dồn virus Tai Xanh, tế bào Marc-145 bán trên các hạt Cytodex khoảng 5-10% thể hiện ở hình 4.8.
Từ các kết quả hiệu giá virus bảng 4.13 chúng tôi lựa chọn đông tan 1 lần để thu hoạch virus Tai Xanh trên hệ thống Microcarrier.
Sau khi thực hiện các nghiên cứu, tối ưu và lựa chọn được các thông số kĩ thuật, chúng tôi đưa ra được quy trình sản xuất kháng nguyên Tai Xanh trên hệ thống Microcarrier.
Sơ đồ sản xuất kháng nguyên Tai Xanh. Tế bào - Tế bào Marc-145
- Lượng tế bào: 30x106TB/3gram Cytodex/1 lít môi trường - Môi trường nuôi: MEM 5% HT+KS
- pH:7,1±0,2 Hệ thống Microcarrier 10L - Tốc độ khuấy: 60 vòng/phút. - Lưu lượng khí : 0,25 – 0,5 lít/ phút. - DO =50% - T0C = 370C±0,5 Nhiễm Virut
Tai Xanh - Môi trường nhiễm: MEM 1% HT+KS - PH= 7,3±0,2
- MOI: 0,01 hấp phụ virut: 60 phút - Thời gian nuôi nhiễm 72 giờ
Thu hoạch virut - Thu vắc xin bán thành phẩm: sau khoảng 72 gây nhiễm, kiểm tra sự hủy hoại của virut lên tế bào đạt ≥ 95% tiến hành thu vắc xin bán thành phẩm
- Đông tan virut 1 lần, thu dồn kháng nguyên, bảo quản - 40˚C.
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
5.1. KẾT LUẬN
1. Xây dựng được quy trình nuôi cấy tế bào Marc-145 trên hệ thống Microcarrier. Tốc độ khuấy 60 vòng/phút, tế bào bám hạt sau 24h, phát triển 90- 100% sau 72-96h, môi trường nuôi không tạo bọt; giá trị DO=50% tế bào phát triển tốt nhất; Lưu lượng khí 0,25-0,5 lít/phút sau 3 giờ 50 phút ổn định được giá trị DO và pH môi trường; môi trường MEM bổ sung 5% huyết thanh và tế bào đầu vào 300x106tb/30gram hạt Cytodex nuôi 10 lít môi trường là tốt nhất.
2. Xây dựng được quy trình sản xuất virus Tai Xanh trên hệ thống Microcarrier sử dụng MOI: 0,01; môi trường nhiễm là MEM 1% huyết thanh ; hấp phụ virut 60 phút, dịch hấp phụ không hút bỏ, thu hoạch virus sau 72 giờ cho hiệu giá virut 107,2-107,5TCID50/ml.
3. Quá trình thu hoạch virus đông tan 1 lần cho hiệu giá virus cao nhất.
5.2. KIẾN NGHỊ
- Sử dụng kết quả của nghiên cứu này để sử dụng cho sản xuất vacxin Tai Xanh bán thành phẩm.
- Vacxin Tai Xanh bán thành phẩm đem đông khô thử nghiệm, kiểm tra hiệu giá virus trong vacxin thành phẩm, tính an toàn, tính miễn dịch và hiệu lực của vacxin để đánh giá chất lượng của vacxin.
- Sử dụng kết quả nghiên cứu làm tiền đề để nghiên cứu sản xuất nhiều loại vacxin khác trên hệ thống Microcarrier.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
I. Tài Liệu Tiếng Việt:
1. Phan Kim Ngọc Và Phạm Văn Phúc (2009). "Công nghệ sinh học trên người và động vật", NXB Giáo dục,Tp.HCM.
2. Nguyễn Thị Lan Và Cs (2016). " so sánh một số đặc tính sinh học của chủng virus PRRS phân lập tại Việt Nam (KTY-PRRS-04) qua các đời cấy truyền".
3. Vũ Văn Vụ Và Nguyễn Mộng Hùng (2006). "Công nghệ sinh học tế bào ".NXB ĐH Huế.
4. Nguyễn Hoàng Lộc (2006). " Công nghệ tế bào". NXB ĐH Huế.
5. Nguyễn Như Hiền (2007). " Sinh học phân tử và tế bào, cơ sở khoa học của công nghệ sinh học".
6. Bùi Quang Anh (2008). " Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS). " Nhà xuất bản Nông nghiệp. tr. 7-21.
7. Nguyễn Thị Lan (2016). " Đặc tính sinh học của chủng virus PRRS (KTY-PRRS- 05) Phân lập tại Việt Nam qua các đời cấy truyền. " Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam.(4).tr. 605.
8. Nguyễn Thị Minh Hường (2015). " Nghiên cứu, so sánh khả năng gây bệnh tích tế bào và một số đặc điểm sinh học phân tử của virus PSSR qua các đời cấy chuyển trên môi trường tế bào Marc-145". tr..36-38.
II. Tài Liệu Tiếng Anh:
1. Butler (2004). Animal cell culture and technology, Taylor & Francis.
2. Christianson, Collins, Benfield and Harris (1992). "Experimental reproduction of swine infertility and respiratory syndrome in pregnant sows." American journal of veterinary research. 53(4). pp.485-488.
3. Christian Kaisermayer, Ann-Christin Magnusson and J Tscho (2013). "Scale-Up of Adherent Vero Cells Grown on Cytodex™ Microcarriers Using WAVE Bioreactor™ Systems." BioProcess Int. 11(7).
4. Ce Rexroad Jr and Am Powell (1988). "Co-culture of ovine ova with oviductal cells in medium 199." Journal of animal science 66(4).pp. 947-953.
5. Colin Ratledge and Bjorn Kristiansen (2006). Basic biotechnology, Cambridge University Press.
6. D He, C Overend, J Ambrogio, Rj Maganti, Mj Grubman and Ae Garmendia (2011). "Marked differences between MARC-145 cells and swine alveolar macrophages in IFNβ-induced activation of antiviral state against PRRSV." Veterinary immunology and immunopathology 139(1).pp. 57-60.
7. Dea S., C. Gagnon, H. Mardassi, Pirzadeh and And Rogan (2000). "Current knowledge on the structural proteins of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus: comparison of the North American and European isolates." Archives of virology. 145(4).pp.659-688
8. Enda Moran (1999). "A microcarrier-based cell culture process for the production of a bovine respiratory syncytial virus vaccine." Cytotechnology. 29(2).pp. 135.
9. Ge Healthcare and Amersham Biosciences (2005). "Microcarrier cell culture: principles and methods." General Electric Company.
10. Kd Rossow (1998). "Porcine reproductive and respiratory syndrome." Veterinary pathology 35(1).pp.1-20.
11. Kim Jeong-Ki, Al-Majhdi Fahad, Kumar Shanmukhappa and Sanjay Kapil (2006). "Defining the cellular target (s) of porcine reproductive and respiratory syndrome virus blocking monoclonal antibody 7G10." Journal of virology 80(2).pp. 689-696. 12. Kj Yoon, J Christopher-Hennings and Ea Nelson (2003). "Diagnosis of PRRS
virus." PRRS Compendium Producer Edition. 55: 67.
13. Kjell Nilsson (1988). "Microcarrier cell culture." Biotechnology and genetic engineering reviews 6(1).pp.404-439.
14. J. Y. Liu, J. Hafner, G. Dragieva and G. Burg (2004). "Bioreactor microcarrier cell culture system (Bio-MCCS) for large-scale production of autologous melanocytes." Cell Transplant 13(7-8).pp.809-816.
15. Janneke Jm Meulenberg (2000). "PRRSV, the virus." Veterinary research 31(1).pp. 11-21.
16. Jovan Bojkovski, Ivan Doborasvljević, Nikola Delić, Božidar Savić, Dragan Rogožarski and Tihomir Petrujkić (2012). "Porcine reproductive respiratory syndrome (PRRS)." Savremena poljoprivreda. 61(1-2).pp.61-67.
17. Oekyung Kim, Yan Sun, Frances W Lai, Cheng Song and Dongwan Yoo (2010). "Modulation of type I interferon induction by porcine reproductive and respiratory syndrome virus and degradation of CREB-binding protein by non-structural protein 1 in MARC-145 and HeLa cells." Virology 402(2).pp.315-326.
18. R Ian Freshney (2015). Culture of animal cells: a manual of basic technique and specialized applications, John Wiley & Sons.
19. Ryan (2005). Growing more cells: A simple guide to small volume cell culture scale-up.
20. William T Christianson and Hansoo Joo (1994). "Porcine reproductive and respiratory syndrome: A review." Swine health and production: the official journal of the American Association of Swine Practitioners (USA).
PHỤ LỤC Phụ lục 1
Phân tích dữ liệu tìm môi trường gây nhiễm virus Tai Xanh ANOVA/One-way : DMEM, MEM, M199, LH
Source DF SS MS F P Factor 3 5.0400 1.6800 45.47 0.000 Error 32 1.1822 0.0369
Total 35 6.2222
S = 0.1922 R-Sq = 81.00% R-Sq(adj) = 79.22% Grouping Information Using Tukey Method
N Mean Grouping MEM 9 7.5444 A M199 9 7.3000 A DMEM 9 6.9000 B LH 9 6.5667 C
Phụ lục 2
Phân tích dữ liệu đông tan thu dồn virus Tai Xanh
ANOVA/One-way: Thu tƣơi, Đông tan 1 lần, Đông tan 2 lần
Source DF SS MS F P Factor 2 2.81079 1.40539 164.69 0.0001 Error 9 0.07680 0.00853 Total 11 2.88759 S = 0.09238 R-Sq = 97.34% R-Sq(adj) = 96.75%
Grouping Information Using Tukey Method
N Mean Grouping Đông tan 2 lần 4 7.5233 A Đông tan 1 lần 4 7.5233 A Thu tươi 4 6.4967 B