Để xác định liều gây nhiễm thích hợp cho kết quả xác định hiệu giá virus cao nhất, tiến hành gây nhiễm virus Tai Xanh trên hệ thống Microcarrier chứa một lớp tế bào Marc-145 với 4 liều gây nhiễm (MOI- Multiplicity of infection) lần lượt 0,2MOI; 0,1MOI; 0,01MOI; 0,001MOI. Mỗi liều MOI thí nghiệm/1 bình Microcarrier, tiến hành theo dõi mức độ biểu hiện bệnh tích tế bào, lấy mẫu xác định hiệu giá virus Tai Xanh sau 48 giờ, 54 giờ, 72 giờ và 96 giờ gây nhiễm.
Thí nghiệm lặp lại 3 lần và cố định cách thực hiện và thông số:
Thời gian ủ virus Tai xanh vào tế bào Marc-145: 60 phút ở 37˚C, 5% CO2 Môi trường nuôi nhiễm là MEM 1%FBS + kháng sinh
Cài đặt các thống số hệ thống: Tốc độ khuấy: 60vòng/phút, lưu lượng khí: 0,5lít/phút, giá trị DO=50%.
Bảng 4.11. Kết quả theo dõi mức độ thể hiện CPE ở các liều gây nhiễm Thời gian Thời gian
gây nhiễm virus Liều gây nhiễm virus (MOI)
0,2 0,1 0,01 0,001 Bệnh tích Tế bào (%) 24 0 0 0 0 48 30-40 10 10 0 54 50-60 30-40 30-40 10 72 70-80 70-80 60-70 30-40 96 100 100 100 50-60
Hàng ngày quan sát tế bào để đánh giá mức độ bệnh tích tế bào (CPE) ở các liều gây nhiễm và thời gian gây nhiễm khác nhau. Mức độ biểu hiện CPE được đánh giá bảng 4.11.
Qua bảng theo dõi mức độ biểu hiện CPE ta thấy sau 24 giờ gây nhiễm virus Tai Xanh tất cả các liều virus nhiễm đều chưa biểu hiện bệnh tích tế bào và bệnh tích tế bào thể hiện nhanh và mạnh dần cùng với sự tăng của liều nhiễm virus. Bệnh tích tế bào thể hiện rõ và mạnh nhất ở liều 0,1MOI và 0,01MOI. Sau 48 giờ gây nhiễm virus mới bắt đầu xuất hiện bệnh tích tế bào và sau 96 giờ thì hầu như tế bào bong hoàn toàn khỏi hạt Cytodex và thảm tế bào.
24h 48h
72h 96h
Hình 4.7. Bệnh tích tế bào 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ và 96 giờ sau gây nhiễm virus Tai xanh
Mỗi thời điểm theo dõi, tiến hành lấy mẫu soi bệnh tích tế bào và xác định hiệu giá virus để so sánh giữa các liều gây nhiễm, thời gian thu hoạch virus. Kết quả được trình bày bảng 4.12
Bảng 4.12. Kết quả xác định hiệu giá virus của các liều gây nhiễm (MOI) Thời gian
gây nhiễm virus
Liều gây nhiễm virus (MOI)
0,2 0,1 0,01 0,001
Hiệu giá virus (log10TCID50/ml)
48 7,26±0,08 7,14±0,08 6,61±0,14 4,72±0,11
54 6,57±0,05 6,54±0,08 7,19±0,11 5,83±0,16
72 5,72±0,18 6,1±0,06 7,54±0,08 6,32±0,22
96 5,06±0,23 4,94±0,23 6,82±0,13 7,14±0,08
Qua bảng kết quả xác định hiệu giá virus bảng 4.12. Hiệu giá virus Tai Xanh có sự khác biệt giữa các liều nhiễm virus khác nhau và thời gian nuôi nhiễm.
Ở liều gây nhiễm 0,2MOI và 0,1MOI sau 48 giờ gây nhiễm cho kết quả xác định hiệu giá virus đạt cao nhất, trung bình là 7,26 log10TCID50/ml và sau 54 giờ gây nhiễm virus cho kết quả xác định hiệu giá bắt đầu giảm, theo dõi đến 96 giờ sau nhiễm cho kết quả xác định hiệu giá virus còn 5,06 log10TCID50/ml giảm 2,2 log10TCID50/ml tức 158 lần.
Ở liều gây nhiễm 0,01MOI hiệu giá virus tăng dần theo thời gian gây nhiễm, kết quả xác định hiệu giá đạt cao nhất sau 72 giờ gây nhiễm (7,54 log10TCID50/ml), sau 96 giờ nuôi nhiễm kết quả xác định hiệu giá virus bắt đầu giảm dần. Kết quả này giống với các kết quả nghiên cứu đã được công bố (Nguyễn Thị Lan và cs., 2016)
Ở liều gây nhiễm 0,001MOI, mức độ thể hiện bệnh tích tế bào thấp hơn so với các liều gây nhiễm khác nên kết quả xác định hiệu giá virus thấp và cao nhất sau 96 giờ gây nhiễm (6,14 log10TCID50/ml).
Sau khi đã xác định được liều gây nhiễm virus Tai Xanh thích hợp, chúng tôi tiến hành nghiên cứu thời gian thu hoạch virus để có kết quả xác định hiệu giá virus cao nhất. Liều 0,01MOI theo quy trình và thông số hệ thống đã nghiên cứu, virus được theo dõi và thu hoạch ở các thời điểm lần lượt là 24 giờ; 36 giờ; 48
giờ; 60 giờ; 72 giờ; 84 giờ; 96 giờ; 108 giờ và 120 giờ sau gây nhiễm. Xác định hiệu giá virus tại các thời điểm thu hoạch và kết quả thu được hình 4.8.
Hình 4.8. Đồ thị sinh trƣởng và phát triển virus Tai Xanh (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Qua hình 4.8 cho thấy chu kỳ sinh trưởng phát triển của virus Tai Xanh tương đối ổn định. Sau gây nhiễm 24 giờ virus bắt đầu quá trình sinh trường phát triển, hàm lượng virus thu được tăng dần theo thời gian nhiễm và đạt kết quả xác định hiệu giá cao nhất (7,2- 7,5 log10TCID50) khoảng thời gian 72-84 giờ sau gây nhiễm. Sau 96 giờ, kết quả xác định hiệu giá virus bắt đầu giảm. Điều này có thể giải thích như sau: Khi virus xâm nhập vào tế bào sau 24 giờ virus bắt đầu quá trình sinh trưởng thì cũng là lúc virus bắt đầu gây những ảnh hưởng bất lợi cho tế bào. Sự phát triển của virus càng mạnh thì tế bào càng bị ảnh hưởng nghiêm trọng và dẫn đến phá hủy tế bào. Khi kết quả xác định hiệu giá virus đạt cao nhất tại thời điểm 72-84 giờ sau gây nhiễm thì cũng là lúc tế bào bị phá hủy hoàn toàn. Khi tế bào bị phá hủy hoàn toàn thì virus không còn kí chủ kí sinh, hay nói cách khác là tế bào không còn môi trường thuận lợi để phát triển và phải tồn tại ở dạng tự do. Ở dạng này, virus có sức đề kháng thấp, do tác động nhiệt độ nên nhanh chóng bị mất hoạt tính làm giảm hiệu giá virus (Nguyễn Thanh Ba và Nguyễn Thị Ngọc, 2014; Butler, 2004).
Từ kết quả bảng 4.12 và hình 4.8 lựa chọn liều gây nhiễm 0,01MOI, thu hoạch virus sau 72 giờ gây nhiễm.
4.3. NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH THU HOẠCH-THU DỒN DỊCH VIRUS TAI XANH TAI XANH
Sau khi tối ưu được quy trình nuôi nhiễm virus Tai Xanh, chúng tôi tiến hành nghiên cứu quy trình thu hoạch virus Tai Xanh sao cho thu được kháng nguyên có hiệu giá virus cao nhất. Virus bị ảnh hưởng rất nhiều bởi nhiệt độ, quá trình đông tan kháng nguyên.
Đông tan kháng nguyên quá nhiều lần, virus thích ứng với nhiệt độ kém, hiệu giá virus giảm. Còn nếu không đông tan kháng nguyên, virus gây bệnh tích bên trong tế bào, virus không được giải phóng ra ngoài gây giảm hiệu giá virus, kết quả chuẩn độ không được chính xác.
Chúng tôi tiến hành thí nghiệm lần lượt là không đông tan, đông tan 1 lần và đông tan 2 lần với kháng nguyên sau 72 giờ nhiễm. Các thông số nuôi tế bào Marc-145 và gây nhiễm virus Tai Xanh thực hiện theo các nghiên cứu ở trên, cố định các thông số cài đặt máy đã tối ưu, thí nghiệm được thực hiện 3 lần.
- Tiến hành lấy mẫu tại 3 thời điểm:
Sau nhiễm 72-96 giờ, tế bào bong khỏi hạt Cytodex 90-100%: Thu tươi
Dịch virus đem cất -40˚C tới đông mang đông tan lần 1 : đông tan 1 lần
Sau đông tan 1 lần cất -40˚C tới đông mang đông tan lần 2 : đông tan 2 lần Kết quả xác định hiệu giá virus trình bày bảng 4.13
Bảng 4.13. Kết quả xác định hiệu giá virus thu dồn kháng nguyên Tai Xanh (log10TCID50/ml)
Lô thí nghiệm Hiệu giá virus (log10TCID50/ml)
Thu tƣơi Đông tan 1 lần Đông tan 2 lần Lô 1 6,63 ±0,09 7,57 ±0,05 7,37 ±0,21
Lô 2 6,43 ±0,15 7,43 ±0,14 7,57 ±0,18
Lô 3 6,43 ±0,20 7,57 ±0,18 7,63 ±0,09
Trung bình 6,50 ±0,09 7,52 ±0,07 7,52 ±0,11
Quá trình thu tươi nguyên dich hiệu cho kết quả giá xác định hiệu giá virus Tai Xanh thấp khoảng 6,43-6,63 log 10TCID50/ml, chứng tỏ virus Tai Xanh xâm nhập vào trong tế bào Marc-145 gây bệnh tích tế bào, không có quá trình đông tan nên virus chưa được giải phóng khỏi tế bào.
virus giao động khoảng 7,37-7,63 log10TCID50 /ml tăng 1,0-1,2log10 so với thu dịch tươi. Kết quả xác định hiệu giá trung bình của đông tan 1 lần và đông tan 2 lần đều cho kết quả hiệu giá virus giống nhau 7,52 log10TCID50/ml. Tuy nhiên, quá trình đông tan nhiều lần có thể dẫn đến nứt chai, thao tác nhiều gây tạp trùng, tăng thời gian sản xuất.
Quá trình thu dồn dịch, chúng tôi tiến hành lấy mẫu kiểm tra độ thuẩn khiết kết quả thu được thể hiện bảng 4.14: