HỆ THỐNG MICROCARRIER
4.1.1. Xác định tốc độ khuấy thích hợp để nuôi tế bào Marc-145 trên hệ thống Microcarrier
Tốc độ khuấy nhanh hay chậm đều ảnh hưởng tới sự bám và phát triển tế bào trên bề mặt của các hạt Cytodex. Mặt khác, trong môi trường nuôi tế bào hay môi trường duy trì tế bào sau nhiễm đều có chứa một lượng huyết thanh nhất định khi tốc độ khuấy không thích hợp sẽ tạo ra bọt gây hiện tượng môi trường trào lên nắp ảnh hưởng đến vô trùng trong bình nuôi và sự phát triển của tế bào nên tìm ra được độ khuấy thích hợp là rất cần thiết.
Để lựa chọn tốc độ khuấy thích hợp nuôi cấy tế bào Marc-145 trên hệ thống Microcarrier, thí nghiệm được thực hiện với 4 tốc độ khuấy: 20, 40, 60, 80 (vòng/phút). Thí nghiệp lặp lại 3 lần, điều kiện nuôi cấy tế bào giống nhau và theo dõi chỉ tiêu: khả năng lắng hạt Cytodex, khả năng tạo bọt của môi trường nuôi và hằng ngày lấy mẫu theo dõi sự phát triển của tế bào trên hạt Cytodex.
Kết quả theo dõi được trình bày bảng 4.1:
Bảng 4.1. Kết quả theo dõi điều chỉnh tốc độ khuấy Chỉ tiêu theo dõi Tốc độ khuấy (vòng/phút)
20 40 60 80
Khả năng lắng
hạt lắng hạt nhanh lắng hạt không lắng không lắng Tạo bọt môi trƣờng không tạo bọt không tạo bọt không tạo bọt tạo bọt Độ bám tế bào (%) 24h 5-10% 5-10% 10-20% 10-20% 48h 30-40% 30-40% 40-50% 40-50% 72h 60-70% 50-60% 80-90% 70-80% 96h 80-90% 80-90% 100% 100% Kết quả điều chỉnh tốc độ khuấy cho thấy: Điều chỉnh tốc độ khuấy từ 20 vòng/phút đến 60 vòng/phút môi trường nuôi không tạo bọt tuy nhiên ở tốc độ khuấy 20 vòng/phút và 40 vòng/phút các hạt Cytodex bị lắng xuống đáy bình
nhanh còn ở tốc độ khuấy 60 vòng/phút không bị lắng các hạt Cytodex xuống đáy bình. Ở tốc độ khuấy 80 vòng/phút các hạt Cytodex không bị lắng nhưng môi trường nuôi tạo bọt.
(1) (2)
Hình 4.1. (1) Bình nuôi có bọt, (2) bình nuôi cấy không có bọt
Độ bám tế bào ở từng tốc độ khuấy khác nhau cũng khác nhau.
Ở tốc độ khuấy 20-40 vòng/phút sau 24 giờ nuôi tế bào bám và phát triển khoảng 5- 10%, đến 72 giờ nuôi tế bào bám khoảng 50-60% hạt Cytodex và sau 96 giờ nuôi tế bào Marc-145 vẫn chưa bám kín hạt Cytodex khoảng 80-90%, phía đáy bình nuôi các hạt Cytodex lắng xuống có hiện tượng tế bào phát triển không đều.
Ở tốc độ khuấy 60 vòng/phút tế bào bám và phát triển sau 24 giờ nuôi khoảng 10-20%, sau 72-96 giờ tế bào phát triển và bám kín hạt Cytodex 90-100%.
Tốc độ khuấy 80 vòng/phút do tốc độ khuấy mạnh nên môi trường tạo bọt, tế bào bám và phát triển sau 24 giờ nuôi, sau 96 giờ nuôi tế bào bám kín hạt Cytodex, tuy nhiên mức độ bám tế bào trên hạt Cytodex không đều, hạt dày, hạt thưa tế bào.
Kết quả theo dõi thí nghiệm bảng 4.1: Tốc độ khuấy 60 vòng/phút không tạo bọt môi trường nuôi, không làm lắng hạt Cytodex xuống đáy bình, tế bào Marc-145 phát triển và bám kín hạt Cytodex sau 72-96 giờ nuôi. Vậy nên chọn tốc độ khuấy 60 vòng/phút làm tốc độ khuấy cho các thí nghiệm tiếp theo của nuôi tế bào Marc-145 trên hệ thống Microcarrier. Kết quả tốc độ phù hợp với nuôi cấy tế bào theo nghiên cứu của GE healthcare (R Ian Freshney 2015).
4.1.2. Xác định giá trị DO thích hợp để nuôi cấy tế bào Marc-145 trên hệ thống Microcarrier thống Microcarrier
DO (Dissolved Oxygen) là nồng độ Oxy hòa tan trong nước, hàm lượng O2 trong nước hay môi trường nuôi rất cần thiết cho sự hô hấp của tế bào. Nồng độ oxy trong môi trường thấp sẽ gây ức chế và giảm sự phát triển của tế bào. Tiến hành xác định giá trị DO thích hợp để nuôi cấy tế bào Marc-145 trên hệ thống Microcarrier, cài đặt các giá trị DO lần lượt là: 20%; 30%; 40%; 50%. Thực hiện thí nghiệm 3 lần, cố định các thông số đầu vào như mật độ nuôi tế bào, môi trường nuôi tế bào, cài đặt hệ thống: lưu lượng khí 0,5 lít; tốc độ khuấy 60 vòng/phút. Theo dõi các chỉ tiêu: mức độ bám tế bào Marc-145 vào hạt Cytodex sau 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ nuôi và xác định năng suất sinh sản của tế bào sau 72 giờ nuôi.
Kết quả thí nghiệm trình bày bảng 4.2:
Bảng 4.2. Mức độ bám tế bào Marc-145 vào hạt Cytodex ở các giá trị DO khác nhau
Chỉ tiêu theo dõi
Nồng độ oxi hòa tan - DO (%)
20 30 40 50 Độ bám tế bào (%) 24h 10-20 10-20 20-25 20-30 48h 30-40 40-50 40-50 50-60 72h 60-70 70-80 80-90 90-95
Kết quả theo dõi cho thấy mức độ bám và phát triển của tế bào Marc- 145 khác nhau ở các giá trị DO khác nhau, sau 24 giờ nuôi tế bào bắt đầu bám vào hạt Cytodex. Tuy nhiên, tế bào ở bình có giá trị DO=20-30% phát triển kém hơn (tế bào bám khoảng 10-20%) tế bào ở bình DO=40-50% (tế bào bám khoảng 20-30%). Sau 72 giờ nuôi, DO=20-30% tế bào bám khoảng 70-80% trên bề mặt hạt Cytodex. Giá trị DO=40-50% sự nhân lên và phát triển của tế bào tốt hơn, bám gần hết kín hạt Cytodex khoảng 80-90%.
Sau 72 giờ nuôi tế bào, tiến hành lấy mẫu, tách tế bào xác định năng suất sinh sản của tế bào ở các giá trị DO khác nhau.
Hình 4.2. Lấy mẫu theo dõi năng suất nhân tế bào Marc-145
Kết quả tỉ suất sinh sản tế bào Marc-145 được trình bày bảng 4.3:
Bảng 4.3. Tỉ suất sinh sản tế bào Marc-145 sau 72 giờ nuôi Giá trị DO
(%)
Số lƣợng tế bào vào
(x106)
Số lƣợng tế bào sau 72h nuôi (x106) Tỉ suất (lần) 20 750 ±30 9497 ±47 12,6 ±0,63 30 750 ±30 9957 ±63 13,2 ±0,84 40 750 ±30 15283 ±53 20,4 ±0,70 50 750 ±30 16653 ±30 22,2 ±0,41
Ghi chú: DO- Dissolved Oxygen: Nồng độ oxi hòa tan
Chúng tôi thu được kết quả đếm số năng suất sinh sản tế bào Marc-145 bảng 4.3. Nuôi cấy tế bào ban đầu cố định 750x106 tế bào/bình ở các giá trị DO khác nhau cho năng suất sinh sản tế bào khác nhau. Giá trị DO=20-30% năng suất nhân tế bào gấp 12-13 lần so với tế bào đầu vào. Giá trị DO= 40% năng suất nhân lên hơn 20 lần so với tế bào đầu vào. Ở giá trị DO= 50% năng suất của tế bào đạt cao nhất hơn 22 lần.
Kết quả đếm số phù hợp với mức độ bám, phát triển của tế bào trên hạt Cytodex ở từng giá trị DO được trình bày ở bảng 4.2. Tuy nhiên, năng suất sinh sản tế bào Marc-145 trên hệ thống Microcarrier chưa đạt được năng suất sinh sản
cao nhất trên hệ thống chai Tfask đang sản xuất. Các thí nghiệm tiếp theo, chúng tôi tiến hành tối ưu các yếu tố khác để thu được năng suất sinh sản tế bào Marc-145 cao nhất.
Từ kết quả thí nghiệm trên, giá trị DO= 50% đang cho tế bào Marc-145 phát triển tốt nhất, năng suất sinh sản cao nhất, nên lựa chọn cài đặt hệ thống DO=50% cho các thí nghiệm tiếp theo.
4.1.3. Xác định lƣu lƣợng khí cấp vào thích hợp để nuôi cấy tế bào Marc- 145 trên hệ thống Microcarrier
Sau khi đã xác định được tốc độ khuấy và nồng độ oxi hòa tan- DO thích hợp nuôi tế bào Marc-145 trên hệ thống Microcarrier. Chúng tôi tiến hành xác định lưu lượng khí cấp vào để nuôi cấy tế bào Marc-145. Lưu lượng khí được thiết kế cấp vào hệ thống Microcarrier khoảng 0,2-1,0 lít/phút. Để xác định lưu lượng khí cấp vào chúng tôi sử dụng khí trộn của 4 loại khí: N2, O2, CO2 và không khí. Tiến hành thí nghiệm với 4 lưu lượng khí lần lượt là 0,25 lít/phút; 0,5 lít/phút; 0,75 lít/phút, 1,0 lít/phút. Đồng thời, tiến hành xác định thêm thời gian máy điều khiển lưu lượng khí để điều chính các thông số pH và DO ổn định. Thí nghiệm được thực hiện 3 lần, cố định các điều kiện nuôi tế bào, cài đặt hệ thống: tốc độ khuấy 60 vòng/phút; DO= 50% và pH=7,2 ±0,2.
Hệ thống khí gồm 4 khí O2, N2, CO2 và không khí, các khí tổng chia ra các dây dẫn khí đi vào từng hệ thống. Ở hệ thống sẽ cài đặt lưu lượng khí thích hợp cho việc nuôi tế bào, các khí trộn với nhau qua bình khí của hệ thống rồi đi vào bình nuôi tế bào.
Bảng 4.4. Kết quả điều chỉnh lƣu lƣợng khí cấp vào môi trƣờng nuôi Lƣu lƣợng khí (lít/phút) Tạo bọt môi trƣờng Thời gian ổn định DO, pH 0,25 Không 3 giờ 50 phút 0,5 Không 3 giờ 50 phút 0,75 Có 3 giờ 50 phút 1,0 Có 4 giờ 00 phút
Ghi chú: DO- Dissolved Oxygen: Nồng độ oxi hòa tan
Từ kết quả bảng 4.4 thu được, chúng tôi có thể nhận thấy lưu lượng khí từ 0,25 lít/phút đến 0,5 lít/phút không tạo bọt môi trường nuôi, còn lưu lượng khí từ 0,75 lít/phút trở lên tạo bọt môi trường nuôi. Các lưu lượng khí khác nhau, thời gian điều chỉnh giá trị DO và pH ổn định ở mức pH=7,2±0,2 và DO=50% đều tương đương nhau, khoảng 3 giờ 50 phút.
Từ kết quả thu được, chúng tôi lựa chọn lưu lượng khí 0,25-0,5 lít/phút cho các thí nghiệm tiếp theo.
4.1.4. Xác định môi trƣờng nuôi cấy thích hợp cho tế bào Marc-145 trên hệ thống Microcarrier
Năng suất sinh sản tế bào ảnh hưởng trực tiếp bởi môi trường nuôi không thích hợp. Để tìm ra công thức môi trường nuôi tối ưu nhất cho sự phát triển cũng như sự nhân của tế bào, tiến hành thí nghiệm nuôi cấy tế bào Marc-145 trên 4 công thức môi trường khác nhau là MEM, DMEM, M199 và LH, quá trình thực hiện cố định các thống số cài đặt hệ thống, điều kiện nuôi cấy và theo dõi các chỉ tiêu:
Khả năng bám và phát triển tế bào Marc-145 trên hạt Cytodex Năng suất sinh sản của tế bào sau 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ và 96 giờ.
Để đánh giá năng suất nhân lên của tế bào Marc-145 trên các loại môi trường khác nhau, tiến hành thí nghiệm mỗi loại môi trường một bình Microcarrier với lượng tế bào cấy vào ban đầu cố định là 750x106 tế bào, 50 gram hạt Cytodex cho bình Microcarrier 10 lít, cài đặt các thông số: tốc độ khuấy 60 vòng/phút; lưu lượng khí 0,5 lít/phút; DO=50%; pH=7,2±0,2. Thí
nghiệm được lặp lại 3 lần với các điều kiện nuôi giống nhau. Kết quả theo dõi thí nghiệm được thể hiện ở bảng 4.5:
Bảng 4.5. Khả năng bám và phát triển tế bào Marc-145 trên các loại môi trƣờng
Thời gian theo dõi Môi trƣờng
MEM DMEM M199 LH Độ bám tế bào (%) 24 20-30 10-20 20-30 10-20 48 60-70 30-40 50-60 30-40 72 90-100 70-80 90-95 70-80 96 100 90-100 100 90-100 Qua quá trình theo dõi ở cả 4 loại môi trường nuôi chúng tôi thấy rằng tất cả các môi trường MEM, DMEM, M199 và LH, tế bào Marc-145 đều có khả năng bám, nhân lên và phát triển sau 24 giờ nuôi và sau 72-96 giờ nuôi tế bào bám kín tất cả các hạt Cytodex. Tuy nhiên mức độ nhân lên và bám của tế bào khác nhau trên từng loại môi trường.
Hiện tại, hệ thống nuôi trên chai Tfask 225cm2 chúng tôi đang sử dụng môi trường MEM bổ sung 5%FBS+ kháng sinh, nuôi 72 giờ, cho năng suất nhân là 25-30 lần
Quá trình thực hiện thí nghiệm, chúng tôi tiến hành lấy mẫu theo dõi mức độ phát triển của tế bào trên kính hiển vi và đếm số tế bào sau 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ và 96 giờ nuôi. Kết quả thu được năng suất nhân của tế bào Marc-145 trên từng loại môi trường nuôi khác nhau được thể hiện hình 4.4.
Kết quả hình 4.4 cho thấy tỉ suất sinh sản tế bào Marc-145 trên tất cả môi trường nuôi tế bào đều thích ứng với tế bào Marc-145 và tế bào nhân lên sau 24 giờ nuôi,tế bào phát triển mạnh nhất trong khoảng 48 giờ- 72 giờ nuôi, sau 96 giờ nuôi tế bào không còn nhân lên và phát triển nhiều.
Môi trường MEM cho tỉ suất sinh sản tế bào cao nhất tăng 30-31 lần so với tế bào đầu vào. Môi trường M199 tỉ suất nhân 20-22 lần so với tế bào đầu vào, môi trường DMEM và LH cho tỉ suất sinh sản thấp nhất tăng 17-18 lần so với tế bào đầu vào.
Mỗi một loại tế bào khác nhau sẽ phát triển trên các công thức môi trường nuôi khác nhau , cho nên phải tìm công thức môi trường nuôi thích hợp và tối ưu nhất cho tế bào. Lựa chọn được môi trường tối ưu nhất cần đủ hai yếu tố: tốc độ phát triển và năng suất nhân lên của tế bào. Từ kết quả bảng 4.5 và hình 4.4 môi trường MEM là môi trường nuôi tế bào Marc-145 có tốc độ phát triển nhanh và mạnh nhất (sau 72 giờ nuôi tế bào bám 100%) và tỉ suất nhân lên của tế bào cao nhất (≥30 lần). Từ kết quả thí nghiệm thu được trên, chúng tôi lựa chọn môi trường MEM bổ sung 5%FBS + kháng sinh là môi trường nuôi tế bào Marc-145 trên hệ thống Microcarrier cho các thí nghiệm tiếp theo.
4.1.5. Xác định lƣợng tế bào Marc-145 cấy vào hạt Cytodex trên hệ thống Microcarrier
Sau khi xác định được các thông số cài đặt hệ thống Microcarrier thích hợp nhất nuôi cấy tế bào Marc-145, chúng tôi tiến hành xác định mật độ đầu vào tế bào Marc-145 thích hợp trên hệ thống Microcarrier 10 lít, tiến hành thí nghiệm với mật độ tế bào ban đầu lần lượt 10x106tế bào; 15x106tế bào và 20x106 tế bào tương ứng với các khối lượng hạt Cytodex là 1,0gram; 1,5 gram; 2,0 gram. Môi trường tối ưu cho sự phát triển của tế bào Marc-145 được chọn ra từ mục 4.1.4. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần và các điều kiện nuôi cấy giống nhau.
Kết quả thu thập được thể hiện bảng 4.6:
Bảng 4.6. Số lƣợng tế bào Marc-145 nuôi sau 72 giờ và 96 giờ nuôi Số lƣợng
tế bào vào (x106)
Khối lƣợng hạt Cytodex (gram)
1,0 1,5 2,0
72h 96h 72h 96h 72h 96h
10 327,2±24 327,1±31 350,9+35 369,3±32 344,5±42 401,2±33
15 490,4±35 491,0±38 642,7±41 619,3±40 519,5±38 575,6±36
Lượng tế bào nhân lên và phát triển phụ thuộc vào mật độ tế bào cấp vào và diện tích bề mặt để tế bào phát triển. Kết quả đếm số tế bào thấy rằng cùng một lượng tế bào đầu vào và cùng số lượng hạt Cytodex nuôi 72 giờ và 96 giờ tế bào nhân lên và phát triển tương đương nhau.
Để đánh giá được số lượng tế bào nhân lên sau 72-96 giờ nuôi chúng tôi có hình biểu thị tỉ suất nhân của tế bào theo kết quả đếm số ở bảng 4.6.
Hình 4.5. Tỉ xuất nhân tế bào Marc-145 khi đầu vào tế bào khác nhau
Từ các kết quả đếm số tế bào bảng 4.6 và tỉ suất nhân tế bào Marc-145 hình 4.5, Tế bào Marc-145 đầu vào là 15x106TB/1,5 gram Cytodex cho tỉ xuất nhân tế bào là cao nhất (tăng 42 lần so với tế bào đầu vào). Kết quả phù hợp với nghiên cứu tỉ suất nhân tế bào trên hệ thống chai Tflask khi nghiên cứu về đặc tính sinh sản của tế bào Marc-145.
Dưới đây là một số hình ảnh nuôi tế bào Marc-145 trên hệ thống Microcarrier sau 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ và 96 giờ.
(1) (2)
(3) (4) Hình 4.6. Mức độ bám tế bào Marc-145 trên hạt Cytodex (1)24giờ nuôi, (2) 48 giờ nuôi. (3) 72 giờ nuôi, (4) 96 giờ nuôi
Kết quả nghiên cứu trên, lựa chọn tế bào đầu vào là 15x106TB/1,5 Gram Cytodex tương đương với 300x106TB/30gram hạt Cytodex cho hệ thống Microcarrier 10 lít. Kết quả này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của (A Ryan Ryan 2005)
4.2. NGHIÊN CỨU TÍNH THÍCH ỨNG CỦA VIRUS TAI XANH NUÔI CẤY TRÊN TẾ BÀO MARC-145 BẰNG HỆ THỐNG MICROCARRIER