Trên buồng đếm tế bào có 2 vùng đếm, 1 vùng ở trên và 1 vùng ở dưới. Mỗi vùng có 4 ô đếm. 1mm 1mm 1mm 1m m Vùng đếm Ô đếm Buồng đếm tế bào
Khi đếm, kết quả đếm được tính trên cả 2 vùng đếm bao gồm 8 ô đếm.
- Trong mỗi ô đếm, thứ tự đếm được mô tả như trên hình vẽ.
Tiến hành đếm số lượng tế bào
Dùng pipetman hút lên nhả xuống 5 lần hỗn dịch tế bào và thuốc nhuộm rồi hút một lượng nhỏ hỗn dịch tế bào.
Đưa đầu típ vào vị trí cạnh của phiến kính đậy rồi bơm thật nhẹ hỗn dịch tế bào trong đầu típ ra để hỗn dịch tế bào đi vào buồng đếm bằng lực mao dẫn đến khi hỗn dịch tế bào phủ một lớp mỏng kín buồng đếm là được.
Đếm số lượng tế bào bằng kính hiển vị với vật kính 10x. Tiến hành đếm trên cả 2 buồng đếm, mỗi buồng đếm 4 ô vuông 1mm2 (Đếm các tế bào trên các ô đánh số 1)
Chỉ đếm những tế bào sống: là những điểm tròn, sáng trên nền xanh. Đếm các tế bào trong mỗi ô đếm 1mm2
theo hình zic-zắc từ trái qua phải, từ trên xuống dưới.
Các tế bào nằm giữa các cạnh của ô đếm thì chỉ đếm những tế bào nằm giữa cạnh phía trên và cạnh bên trái, không đếm tế bào nằm trên cạnh phía đưới và cạnh bên phải.
Để đảm bảo độ chính xác, số lượng tế bào đếm được ở mỗi ô đếm nên giới hạn trong khoảng 20 -50 tế bào. Nếu số lượng tế bào đếm được trong mỗi ô đếm ít hơn 20 hoặc nhiều hơn 50 cần tiến hành đếm lại với độ pha loãng thích hợp.
Nếu hơn 10% tế bào bám thành cụm phải làm lại từ đầu và bảo đảm các tế bào đã tách riêng rẽ.
Công thức :
C: Hệ số pha loãng tế bào
A: Số tế bào đếm lần 1
B: Số tế bào đếm lần 2
16 : Số ô đếm của 2 buồng (8 ô 2 buồng đếm)
104 : Nghịch đảo thể tích dịch trong 1 ô đếm
d. Phương pháp nuôi cấy tế bào trên hạt nang Cytodex bằng hệ thống Microcarrier.
Chuẩn bị hạt Cytodex:
- Cân Cytodex-1 vào một chai schott hoặc bình tam giác có nắp, rửa hạt Cytodex 1-2 lần bằng PBS(-), láng đều 10 – 15 lần, để lắng, bỏ nước nổi. Sau khi rửa bổ sung PBS(-), đóng nắp, sấy vô trùng 121˚C/30 phút. Bảo quản ở nhiệt độ 2-8˚C
- Sau khi sấy hạt Cytodex, để lắng hạt đổ bỏ dịch trong, bổ sung thêm môi trường nuôi cấy + huyết thanh để loại bỏ PBS(-), để lắng đổ bỏ môi trường. Bổ sung thêm môi trường nuôi cấy + huyết thanh để loại bỏ PBS(-) , lắc đều.
(chú ý: tất cả thao tác đều được làm trong lab, thao tác vô trùng)
Nuôi cấy tế bào Marc-145 trên hệ thống Microcarrier
Hệ thống sau khi được xử lý vô trùng và lắp đặt xong tiến hành chuyển tế bào Marc và hạt cytodex-1 vào hệ thống. Quy trình thực hiện như sau:
Hạt Cytodex sau khi hấp vô trùng chuyển vào Lab vô trùng tiến hành loại bỏ PBS(-). Bổ sung 500ml môi trường nuôi cấy có bổ sung kháng sinh lắc nhẹ để hạt lắng ở nhiệt độ phòng
Hút loại bỏ môi trường, bổ sung 500ml môi trường nuôi cấy + huyết thanh lắc nhẹ để lắng ở nhiệt độ 37ºC (khoảng 30 – 45 phút).
Hút loại bỏ môi trường, bổ sung lượng tế bào Marc-145 đã chuẩn bị vào chai có chứa hạt Cytodex. Sử dụng chai chia 1 lít để chuyển hỗn hợp tế bào và hạt cytodex vào trong bình nuôi của hệ thống Microcarrier. Bổ sung môi trường nuôi cấy theo các công thức đã thiết kế với nồng độ huyết thanh khác nhau vào nuôi tế bào
Kết nối bình nuôi sau khi sấy vào bộ điều khiển, bơm toàn bộ dịch trong bình nuôi ra ngoài, kết nối bình nuôi với chai chứa hạt cytodex, và chai chứa hỗn dịch tế bào. Bơm toàn bộ lượng hạt vào trong bình nuôi sau đó bơm toàn bộ hỗn dịch tế bào vào trong bình nuôi, bật cánh khuấy của hệ thống bình nuôi. Kiểm tra lượng hỗn dịch có trong bình nuôi, kết nối chai môi trường bơm vào bình nuôi cho đủ 500ml. Bật hệ thống khí chế độ tự động (tự động chọn loại khí sục vào bình nuôi). kết nối hệ thống để cân chỉnh điện cực DO và pH, để đảm bảo các điện cực hoạt động tốt, hiển thị chính xác các thông số đo (Kjell Nilsson 1988).
1. Kiểm tra đảm bảo điện cực pH đã được nối đúng với bộ điều khiển. 2. Cắm điện và bật công tắc nguồn hệ
thống nuôi cấy tế bào .
3. Chờ cho thiết bị khởi động xong, Manu chính hiện lên.
4. Nhấn Calibration.
5. Nhấn dòng pH để hiệu chuẩn pH. 6. Dùng nước cất rửa sạch điện cực pH,
thấm khô bằng giấy thấm, nhúng điện cực vào dung dịch pH 7 chuẩn sao cho phần đầu đo ngập hoàn toàn. 7. Nhấn cửa sổ bên dưới dòng Set Zero,
dùng bàn phím nhập giá trị 7,00.