3.1.1. Nghiên cứu quy trình nuôi cấy tế bào Marc-145 trên hệ thống Microcarrier
- Xác định tốc độ khuấy thích hợp để nuôi tế bào Marc-145 trên hệ thống Microcarrier.
- Xác định giá trị DO thích hợp để nuôi cấy tế bào Marc-145 trên hệ thống Microcarrier.
- Xác định lưu lượng khí cấp vào thích hợp để nuôi cấy tế bào Marc-145 trên hệ thống Microcarrier.
- Xác định lượng tế bào Marc-145 cấy vào hạt Cytodex trên hệ thống Microcarrier.
- Xác định môi trường nuôi cấy thích hợp cho tế bào Marc-145 trên hệ thống Microcarrier.
3.1.2. Nghiên cứu tính thích ứng của virus Tai Xanh nuôi cấy trên tế bào Marc-145 bằng hệ thống Microcarrier Marc-145 bằng hệ thống Microcarrier
- Xác định thời gian hấp phụ virus vào tế bào, xử lí dịch ủ virus. - Xác định môi trường duy trì sau gây nhiễm virus.
- Xác định liều gây nhiễm, thời gian thu hoạch thích hợp trên hệ thống Microcarrier.
3.1.3. Nghiên cứu quy trình thu hoạch và xử lí dịch virus sau khi thu hoạch 3.2. ĐỐI TƢỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 3.2. ĐỐI TƢỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
3.2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
- Tế bào Marc-145 đang dùng sản xuất (working cell bank) giữ giống tại công ty Hanvet
- Giống virus nhược độc PRRS Hanvet1.vn đang dùng sản xuất (Product Seed).
3.2.2. Vật liệu nghiên cứu
Thiết bị Dụng cụ
- Hệ thống Microcarrier - Tủ ấm CO2, tủ ấm thường - Máy bơm chân không - Máy khuấy từ - Máy đo pH - Cân phân tích - Cân điện tử - Tủ lạnh 2-8˚C - Tủ lạnh -40˚C , -80˚C
- Box cấy an toàn sinh học cấp 2 - Kính hiển vi soi ngược
- Hạt Cytodex-1
- Đĩa 96 giếng đáy chữ U - Ống falcon 15ml, 50ml
- Chai schott 500ml, 1 lít, 2 lít, 5 lít, 10 lít. - Pipet aid
- Pipet man: 200µl, 1ml, 8 kênh, 12 kênh - Pippet thủy tinh10ml, 20ml
- Đầu tuýp 200µl, 1ml, 5ml - Giấy chỉ thị nhiệt
- Găng tay y tế
- Giá để ống, khay nhôm, rổ nhựa.
Hóa chất:
- Môi trường nuôi cấy tế bào: MEM, DMEM, M199, LH, Hank, PBS... - Hóa chất, huyết thanh : FBS, Tripsin-EDTA, Hepes, Trypan blu... - Môi trường kiểm tra độ thuần khiết: thạch máu, TSB và nước thịt gan yếm khí...
3.3. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
- Phòng tế bào- trung tâm nghiên cứu- Công ty TNHH dược Hanvet- KCN phố nối A- Hưng Yên.
3.4. THỜI GIAN NGHIÊN CỨU - Từ 6/2018 đến 5/2019. - Từ 6/2018 đến 5/2019.
3.5. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.5.1. Phƣơng pháp nuôi cấy tế bào
a. Khôi phục tế bào: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Lấy ống tế bào được bảo quản đông lạnh trong nitơ lỏng ra, rã đông nhanh chóng trong bể ổn nhiệt 37°C. Sau rã đông chuyển ống vào Laminar air flow (Laf) vô trùng, chuyển hỗn dịch tế bào vào ống ly tâm có chứa môi trường nuôi cấy đã được làm ấm của tế bào tương ứng. Ly tâm hỗn dịch tế bào trong khoảng 1500v/5-10 phút.
- Sau ly tâm loại bỏ phần dịch nổi, giữ phần tế bào lắng cặn ở dưới. Hoàn nguyên bằng môi trường nuôi tế bào. Trộn đều bằng cách dùng pipet hút nhả.
- Chuyển toàn bộ dung dịch tế bào này vào chai nuôi tế bào Tfask có môi trường nuôi dưỡng bổ sung huyết thanh và kháng sinh.
- Ủ chai nuôi cấy ở tủ ấm 37°C, 5% CO2.
- Qua 1 ngày, loại bỏ môi trường nuôi dưỡng cũ để loại bỏ DMSO, rửa lớp tế bào bằng dung dịch PBS rồi cho môi trường nuôi dưỡng mới bổ sung huyết thanh. Ủ chai nuôi tế bào ở tủ ấm 37°C, 5% CO2 để tế bào phát triển.
- Hằng ngày theo dõi sự phát triển của tế bào trên kính hiển vi quang học.
b. Tách tế bào
- Rửa chai tế bào bằng PBS(-): 1 – 2 lần. Cho TE 0,05% , láng chai Ủ 37oC, 5 – 15 phút, cho tới khi tế bào co tròn, bắt đầu bong khỏi đáy chai, vỗ nhẹ chai nuôi, trung hòa bằng môi trường 5% huyết thanh. Đếm số tế bào trên buồng đếm hồng cầu, định lượng tế bào. Tính toán và chia tế bào ra các chai nuôi ở tủ ấm 37o
C.
- Hàng ngày quan sát khả năng phát triển của tế trong các chai tế bào trên kính hiển vi quang học.
- Nhân số lượng tế bào trên các chai nuôi cấy
Để đủ số lượng tế bào Marc-145 nuôi trên hệ thống Microcarrie với dung tích 10 lít, 50g hạt Cytodex-1, tế bào Marc-145 cần phải được nhân theo từng cấp độ với quy mô lớn dần. Quy trình nhân số lượng tế bào được mô tả trong hình dưới đây:
Hình 3.1. Mô hình nhân số lƣợng tế bào cho nuôi cấy trên hệ thống Microcarrier
c. Phương pháp đếm tế bào
- Chuẩn bị buồng đếm
Dùng vải gạc sạch, tẩm cồn lau sạch buồng đếm và phiến kính đậy. Để buồng đếm và phiến kính đậy khô hoàn toàn (có thể hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn).
Đặt buồng đếm trên mặt phẳng ngang rồi đặt phiến kính đậy vào vị trí buồng đếm. Chú ý không để phiến kính đậy bị lệch, kênh.
Hình 3.2. Buồng đếm tế bào
Trên buồng đếm tế bào có 2 vùng đếm, 1 vùng ở trên và 1 vùng ở dưới. Mỗi vùng có 4 ô đếm. 1mm 1mm 1mm 1m m Vùng đếm Ô đếm Buồng đếm tế bào
Khi đếm, kết quả đếm được tính trên cả 2 vùng đếm bao gồm 8 ô đếm.
- Trong mỗi ô đếm, thứ tự đếm được mô tả như trên hình vẽ.
Tiến hành đếm số lượng tế bào
Dùng pipetman hút lên nhả xuống 5 lần hỗn dịch tế bào và thuốc nhuộm rồi hút một lượng nhỏ hỗn dịch tế bào.
Đưa đầu típ vào vị trí cạnh của phiến kính đậy rồi bơm thật nhẹ hỗn dịch tế bào trong đầu típ ra để hỗn dịch tế bào đi vào buồng đếm bằng lực mao dẫn đến khi hỗn dịch tế bào phủ một lớp mỏng kín buồng đếm là được.
Đếm số lượng tế bào bằng kính hiển vị với vật kính 10x. Tiến hành đếm trên cả 2 buồng đếm, mỗi buồng đếm 4 ô vuông 1mm2 (Đếm các tế bào trên các ô đánh số 1)
Chỉ đếm những tế bào sống: là những điểm tròn, sáng trên nền xanh. Đếm các tế bào trong mỗi ô đếm 1mm2
theo hình zic-zắc từ trái qua phải, từ trên xuống dưới.
Các tế bào nằm giữa các cạnh của ô đếm thì chỉ đếm những tế bào nằm giữa cạnh phía trên và cạnh bên trái, không đếm tế bào nằm trên cạnh phía đưới và cạnh bên phải.
Để đảm bảo độ chính xác, số lượng tế bào đếm được ở mỗi ô đếm nên giới hạn trong khoảng 20 -50 tế bào. Nếu số lượng tế bào đếm được trong mỗi ô đếm ít hơn 20 hoặc nhiều hơn 50 cần tiến hành đếm lại với độ pha loãng thích hợp. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nếu hơn 10% tế bào bám thành cụm phải làm lại từ đầu và bảo đảm các tế bào đã tách riêng rẽ.
Công thức :
C: Hệ số pha loãng tế bào
A: Số tế bào đếm lần 1
B: Số tế bào đếm lần 2
16 : Số ô đếm của 2 buồng (8 ô 2 buồng đếm)
104 : Nghịch đảo thể tích dịch trong 1 ô đếm
d. Phương pháp nuôi cấy tế bào trên hạt nang Cytodex bằng hệ thống Microcarrier.
Chuẩn bị hạt Cytodex:
- Cân Cytodex-1 vào một chai schott hoặc bình tam giác có nắp, rửa hạt Cytodex 1-2 lần bằng PBS(-), láng đều 10 – 15 lần, để lắng, bỏ nước nổi. Sau khi rửa bổ sung PBS(-), đóng nắp, sấy vô trùng 121˚C/30 phút. Bảo quản ở nhiệt độ 2-8˚C
- Sau khi sấy hạt Cytodex, để lắng hạt đổ bỏ dịch trong, bổ sung thêm môi trường nuôi cấy + huyết thanh để loại bỏ PBS(-), để lắng đổ bỏ môi trường. Bổ sung thêm môi trường nuôi cấy + huyết thanh để loại bỏ PBS(-) , lắc đều.
(chú ý: tất cả thao tác đều được làm trong lab, thao tác vô trùng)
Nuôi cấy tế bào Marc-145 trên hệ thống Microcarrier
Hệ thống sau khi được xử lý vô trùng và lắp đặt xong tiến hành chuyển tế bào Marc và hạt cytodex-1 vào hệ thống. Quy trình thực hiện như sau:
Hạt Cytodex sau khi hấp vô trùng chuyển vào Lab vô trùng tiến hành loại bỏ PBS(-). Bổ sung 500ml môi trường nuôi cấy có bổ sung kháng sinh lắc nhẹ để hạt lắng ở nhiệt độ phòng
Hút loại bỏ môi trường, bổ sung 500ml môi trường nuôi cấy + huyết thanh lắc nhẹ để lắng ở nhiệt độ 37ºC (khoảng 30 – 45 phút).
Hút loại bỏ môi trường, bổ sung lượng tế bào Marc-145 đã chuẩn bị vào chai có chứa hạt Cytodex. Sử dụng chai chia 1 lít để chuyển hỗn hợp tế bào và hạt cytodex vào trong bình nuôi của hệ thống Microcarrier. Bổ sung môi trường nuôi cấy theo các công thức đã thiết kế với nồng độ huyết thanh khác nhau vào nuôi tế bào
Kết nối bình nuôi sau khi sấy vào bộ điều khiển, bơm toàn bộ dịch trong bình nuôi ra ngoài, kết nối bình nuôi với chai chứa hạt cytodex, và chai chứa hỗn dịch tế bào. Bơm toàn bộ lượng hạt vào trong bình nuôi sau đó bơm toàn bộ hỗn dịch tế bào vào trong bình nuôi, bật cánh khuấy của hệ thống bình nuôi. Kiểm tra lượng hỗn dịch có trong bình nuôi, kết nối chai môi trường bơm vào bình nuôi cho đủ 500ml. Bật hệ thống khí chế độ tự động (tự động chọn loại khí sục vào bình nuôi). kết nối hệ thống để cân chỉnh điện cực DO và pH, để đảm bảo các điện cực hoạt động tốt, hiển thị chính xác các thông số đo (Kjell Nilsson 1988).
1. Kiểm tra đảm bảo điện cực pH đã được nối đúng với bộ điều khiển. 2. Cắm điện và bật công tắc nguồn hệ
thống nuôi cấy tế bào .
3. Chờ cho thiết bị khởi động xong, Manu chính hiện lên.
4. Nhấn Calibration.
5. Nhấn dòng pH để hiệu chuẩn pH. 6. Dùng nước cất rửa sạch điện cực pH,
thấm khô bằng giấy thấm, nhúng điện cực vào dung dịch pH 7 chuẩn sao cho phần đầu đo ngập hoàn toàn. 7. Nhấn cửa sổ bên dưới dòng Set Zero,
dùng bàn phím nhập giá trị 7,00.
Hình 3.3. Cân chỉnh điện cực pH
8. Chờ 2-3 phút cho hệ thống cân bằng- giá trị Current value trên màn hình tương đối ổn định.
9. Nhấn Set Zero, dùng bàn phím nhập lại giá trị 7,00 để xác nhận.
10. Dùng nước cất rửa sạch điện cực, thấm khô bằng giấy thấm trung tính, sau đó nhúng ngập đầu điện cực vào dung dịch pH 4 chuẩn.
11. Nhấn cửa sổ bên dưới dòng Set Span, dùng bàn phím nhập giá trị 4,00. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
12. Chờ 2-3 phút cho hệ thống cân bằng- giá trị Current value trên màn hình tương đối ổn định.
13.Nhấn Set Span, dùng bàn phím nhập lại giá trị 4,00 để xác nhận.
Để đảm bảo độ chính xác của phép chuẩn có thể dùng ngay các dung dịch pH chuẩn để kiểm tra lại. Sau khi giá trị chuẩn mới đã được đặt lại nhấn phím Manu để quay lại Manu chính.
1. Nối cable điện cực tới điện cực DO.
2. Đặt tốc độ khuấy 50 vòng /phút 3. Vào Calibration cho DO.
4. Bật khí N2, để 10-30 phút cho khí N2 được bão hòa trong buồng nuôi
5. Nhấn Set Zero sau đó nhập 0 sau đó nhấn phím Set Zero.
6. Tắt khí N2
7. Đặt tốc độ khuấy 50 vòng /phút
8. Bật khí Air, để 10-30 phút cho khí Air được bão hòa trong buồng nuôi.
9. Đợi khoảng 10-30 phút cho ổn định 10. Nhấn Set Span sau đó nhập 100 sau đó
nhấn phím Set Span. Hình 3.4. Cân chỉnh điện cứu DO Sau khi cân chỉnh điện cực, đưa bình nuôi cấy đi sấy ở 121oC trong 60 phút.
Hàng ngày lấy mẫu đếm số lượng tế bào, lấy mẫu chụp ảnh kiểm tra sự phát triển của tế bào. Đến ngày nuôi thứ 5-6 tế bào kín đều trên các hạt có thể đưa sang giai đoạn gây nhiễm virut.
3.5.2. Phƣơng pháp gây nhiễm
Giống nhiễm
- Giống virus nhược độc Tai Xanh - Hiệu giá 107,0 TCID50/ml
Gây nhiễm
Quan sát khi tế bào Marc-145 phát triển kín bề mặt hạt Cytodex tiến hành gây nhiễm virus tai xanh. Quy trình thực hiện như sau:
- Sử dụng bình thu 20 lít để hút loại bỏ môi trường nuôi cấy. Rửa tế bào và hạt Cytodex 2 lần bằng 2 lít Hanks (+) 0,1% gentamycin/lần.
- Sử dụng chai chia 2 lít bổ sung 2 lít môi trường môi trường nuôi cấy có huyết thanh + giống virus Tai xanh vào bình nuôi của hệ thống
khuấy đều hạt 20 phút khuấy/lần)
- Sau 1 giờ bổ sung môi trường nuôi cấy có huyết thanh vừa đủ 5 lít. Tiến hành cài đặt các thông số nhân virus Tai Xanh:
- Cài đặt thông số cho hệ thống Microcarrier : Tốc độ khuấy: 60rpm
pH :7,1 ±0,2 DO: 50%
Lưu lượng khí: 1,0 (khí mix 4 loại CO2, O2,N2, không khí)
Trong quá trình nuôi cấy, tiến hành đánh giá hiệu quả qua các chỉ tiêu như sau: thời gian thành bệnh tích tế bào (CPE), hiệu giá virus nhân lên sau 72 giờ gây nhiễm.
3.5.3. Phƣơng pháp thu hoạch
Lấy mẫu kiểm tra sự hủy hoại của tế bào, khi sự hủy hoại từ 95% trở lên tiến hành gặt thu kháng nguyên. Tắt hệ thống khí, khuấy chờ hạt lắng bơm toàn bộ lượng dịch trong bình nuôi ra chai chứa, đưa đi bảo quản ở -20oC và lấy mẫu kiểm tra vô trùng và hiệu giá trong vacxin bán thành phẩm.
3.5.4. Phƣơng pháp kiểm tra độ thuần khiết (TCVN8684:2011)
Kiểm tra tạp nhiễm vi khuẩn: cấy nguyên dịch trên 2 ống môi (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
trường kiểm tra sau đây: môi trường thioglycollat, môi trường trypticaza đậu tương, môi trường thạch máu. Ủ môi trường đã cấy trong tut ấm 37˚C, theo dõi từ 7 đến 10 ngày.
Kiểm tra tạp nhiễm nấm: mẫu nguyên dịch được ria cấy trên môi
trường thạch Sabouraud. Theo dõi 14 ngày ở nhiệt độ phòng (từ 20˚C đến 25˚C).
MT Mẫu Thioglyconate Trypticase đậu tƣơng Thạch máu Saboraud agar Kết luận Ống 1 Ống 2 Ống 1 Ống 2 Ống 1 Ống 2 Ống 1 Ống 2 Lô... Lô... Lô...
- Đọc kết quả: mẫu nguyên dịch được xem là đạt tiêu chuẩn khi không có bất cứ tạp khuẩn nấm mốc nào mọc trên môi trường kiểm tra trong thời gian theo dõi.
trường canh thang PPLO và trên đĩa thạch PPLO có bổ sung huyết thanh ngựa và chất chiết nấm men. Theo dõi môi trường lỏng trong 14 ngày ở nhiệt độ từ 33˚C đến 37˚C. Tại các thời điểm 3 ngày, 7 ngày, 10 ngày, 14 ngày, lấy canh khuẩn ở môi trường lỏng ria cấy vào môi trường thạch PPLO. Ủ trong tủ ấm 37˚C có 5% khí CO2, theo dõi trong 28 ngày.
- Đọc kết quả: mẫu được xem là đạt khi không có khuẩn lạc Mycoplasma mọc trên môi trường kiểm tra.
3.5.5. Phƣơng pháp xác định chỉ số TCID50
- Xác định trị số TCID50 (liều gây nhiễm 50% tế bào nuôi cấy) bằng phương pháp chuẩn độ virut trên dịch treo tế bào theo Spearman và Karber. Phương pháp tóm tắt như sau:
- Dùng môi trường pha loãng virus theo cơ số 10 trong hộp pha mẫu, mỗi mẫu pha loãng từ 10-1 10-7
- Đĩa tế bào 96 giếng: có tế bào Marc-145 phát triển tốt, phủ kín 100% diện tích đáy, tế bào đã bám chắc. Rửa 2- 3 lần bằng môi trường chuẩn độ không huyết thanh hoặc dung dịch Hank +.
- Nhỏ mẫu đã pha loãng vào giếng của đĩa tế bào (100l/giếng). Mỗi nồng độ gây nhiễm vào một dãy 5 giếng. Lặp lại 2 lần
- Dùng pipet man 200 l và đầu tuýp nhựa vô trùng để nhỏ, mỗi nồng độ thay 1 đầu tuýp mới (có thể sử dụng 1 đầu tuýp cho 1 mẫu, khi đó phải nhỏ từ nồng độ loãng hơn cho đến nồng độ đặc)