TAI XANH
Sau khi tối ưu được quy trình nuôi nhiễm virus Tai Xanh, chúng tôi tiến hành nghiên cứu quy trình thu hoạch virus Tai Xanh sao cho thu được kháng nguyên có hiệu giá virus cao nhất. Virus bị ảnh hưởng rất nhiều bởi nhiệt độ, quá trình đông tan kháng nguyên.
Đông tan kháng nguyên quá nhiều lần, virus thích ứng với nhiệt độ kém, hiệu giá virus giảm. Còn nếu không đông tan kháng nguyên, virus gây bệnh tích bên trong tế bào, virus không được giải phóng ra ngoài gây giảm hiệu giá virus, kết quả chuẩn độ không được chính xác.
Chúng tôi tiến hành thí nghiệm lần lượt là không đông tan, đông tan 1 lần và đông tan 2 lần với kháng nguyên sau 72 giờ nhiễm. Các thông số nuôi tế bào Marc-145 và gây nhiễm virus Tai Xanh thực hiện theo các nghiên cứu ở trên, cố định các thông số cài đặt máy đã tối ưu, thí nghiệm được thực hiện 3 lần.
- Tiến hành lấy mẫu tại 3 thời điểm:
Sau nhiễm 72-96 giờ, tế bào bong khỏi hạt Cytodex 90-100%: Thu tươi
Dịch virus đem cất -40˚C tới đông mang đông tan lần 1 : đông tan 1 lần
Sau đông tan 1 lần cất -40˚C tới đông mang đông tan lần 2 : đông tan 2 lần Kết quả xác định hiệu giá virus trình bày bảng 4.13
Bảng 4.13. Kết quả xác định hiệu giá virus thu dồn kháng nguyên Tai Xanh (log10TCID50/ml)
Lô thí nghiệm Hiệu giá virus (log10TCID50/ml)
Thu tƣơi Đông tan 1 lần Đông tan 2 lần Lô 1 6,63 ±0,09 7,57 ±0,05 7,37 ±0,21
Lô 2 6,43 ±0,15 7,43 ±0,14 7,57 ±0,18
Lô 3 6,43 ±0,20 7,57 ±0,18 7,63 ±0,09
Trung bình 6,50 ±0,09 7,52 ±0,07 7,52 ±0,11
Quá trình thu tươi nguyên dich hiệu cho kết quả giá xác định hiệu giá virus Tai Xanh thấp khoảng 6,43-6,63 log 10TCID50/ml, chứng tỏ virus Tai Xanh xâm nhập vào trong tế bào Marc-145 gây bệnh tích tế bào, không có quá trình đông tan nên virus chưa được giải phóng khỏi tế bào.
virus giao động khoảng 7,37-7,63 log10TCID50 /ml tăng 1,0-1,2log10 so với thu dịch tươi. Kết quả xác định hiệu giá trung bình của đông tan 1 lần và đông tan 2 lần đều cho kết quả hiệu giá virus giống nhau 7,52 log10TCID50/ml. Tuy nhiên, quá trình đông tan nhiều lần có thể dẫn đến nứt chai, thao tác nhiều gây tạp trùng, tăng thời gian sản xuất.
Quá trình thu dồn dịch, chúng tôi tiến hành lấy mẫu kiểm tra độ thuẩn khiết kết quả thu được thể hiện bảng 4.14:
Bảng 4.14. Kết quả kiểm tra vô trùng nguyên dịch Tai Xanh Lô thí nghiệm Thioglyconate Trypticase đậu tƣơng Thạch máu Saboraud agar Kết luận Ống 1 Ống 2 Ống 1 Ống 2 Ống 1 Ống 2 Ống 1 Ống 2 Lô 1 - - - Đạt Lô 2 - - - Đạt Lô 3 - - - Đạt Kết quả cho thấy rằng, 3/3 lô thí nghiệm đều đạt vô trùng.
Phân tích dữ liệu trên MINITAB/ANOVA/One-way (phụ lục 2). Kết quả P ≤0.001 chứng tỏ quá trình thu tươi, đông tan ảnh hưởng đến hiệu giá virus. Đông tan 1 lần hoặc đông tan 2 lần trong cùng nhóm A, chứng tỏ quá trình thu dồn virus đông tan 1 hoặc 2 lần đều được.
(1) (2)
Hình 4.9. Hạt Cytodex sau quá trình thu hoạch virus Tai Xanh
Sau quá trình thu dồn virus Tai Xanh, tế bào Marc-145 bán trên các hạt Cytodex khoảng 5-10% thể hiện ở hình 4.8.
Từ các kết quả hiệu giá virus bảng 4.13 chúng tôi lựa chọn đông tan 1 lần để thu hoạch virus Tai Xanh trên hệ thống Microcarrier.
Sau khi thực hiện các nghiên cứu, tối ưu và lựa chọn được các thông số kĩ thuật, chúng tôi đưa ra được quy trình sản xuất kháng nguyên Tai Xanh trên hệ thống Microcarrier.
Sơ đồ sản xuất kháng nguyên Tai Xanh. Tế bào - Tế bào Marc-145
- Lượng tế bào: 30x106TB/3gram Cytodex/1 lít môi trường - Môi trường nuôi: MEM 5% HT+KS
- pH:7,1±0,2 Hệ thống Microcarrier 10L - Tốc độ khuấy: 60 vòng/phút. - Lưu lượng khí : 0,25 – 0,5 lít/ phút. - DO =50% - T0C = 370C±0,5 Nhiễm Virut
Tai Xanh - Môi trường nhiễm: MEM 1% HT+KS - PH= 7,3±0,2
- MOI: 0,01 hấp phụ virut: 60 phút - Thời gian nuôi nhiễm 72 giờ
Thu hoạch virut - Thu vắc xin bán thành phẩm: sau khoảng 72 gây nhiễm, kiểm tra sự hủy hoại của virut lên tế bào đạt ≥ 95% tiến hành thu vắc xin bán thành phẩm
- Đông tan virut 1 lần, thu dồn kháng nguyên, bảo quản - 40˚C.
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ