Sau khi cân chỉnh điện cực, đưa bình nuôi cấy đi sấy ở 121oC trong 60 phút.
Hàng ngày lấy mẫu đếm số lượng tế bào, lấy mẫu chụp ảnh kiểm tra sự phát triển của tế bào. Đến ngày nuôi thứ 5-6 tế bào kín đều trên các hạt có thể đưa sang giai đoạn gây nhiễm virut.
3.5.2. Phƣơng pháp gây nhiễm
Giống nhiễm
- Giống virus nhược độc Tai Xanh - Hiệu giá 107,0 TCID50/ml
Gây nhiễm
Quan sát khi tế bào Marc-145 phát triển kín bề mặt hạt Cytodex tiến hành gây nhiễm virus tai xanh. Quy trình thực hiện như sau:
- Sử dụng bình thu 20 lít để hút loại bỏ môi trường nuôi cấy. Rửa tế bào và hạt Cytodex 2 lần bằng 2 lít Hanks (+) 0,1% gentamycin/lần.
- Sử dụng chai chia 2 lít bổ sung 2 lít môi trường môi trường nuôi cấy có huyết thanh + giống virus Tai xanh vào bình nuôi của hệ thống
khuấy đều hạt 20 phút khuấy/lần)
- Sau 1 giờ bổ sung môi trường nuôi cấy có huyết thanh vừa đủ 5 lít. Tiến hành cài đặt các thông số nhân virus Tai Xanh:
- Cài đặt thông số cho hệ thống Microcarrier : Tốc độ khuấy: 60rpm
pH :7,1 ±0,2 DO: 50%
Lưu lượng khí: 1,0 (khí mix 4 loại CO2, O2,N2, không khí)
Trong quá trình nuôi cấy, tiến hành đánh giá hiệu quả qua các chỉ tiêu như sau: thời gian thành bệnh tích tế bào (CPE), hiệu giá virus nhân lên sau 72 giờ gây nhiễm.
3.5.3. Phƣơng pháp thu hoạch
Lấy mẫu kiểm tra sự hủy hoại của tế bào, khi sự hủy hoại từ 95% trở lên tiến hành gặt thu kháng nguyên. Tắt hệ thống khí, khuấy chờ hạt lắng bơm toàn bộ lượng dịch trong bình nuôi ra chai chứa, đưa đi bảo quản ở -20oC và lấy mẫu kiểm tra vô trùng và hiệu giá trong vacxin bán thành phẩm.
3.5.4. Phƣơng pháp kiểm tra độ thuần khiết (TCVN8684:2011)
Kiểm tra tạp nhiễm vi khuẩn: cấy nguyên dịch trên 2 ống môi
trường kiểm tra sau đây: môi trường thioglycollat, môi trường trypticaza đậu tương, môi trường thạch máu. Ủ môi trường đã cấy trong tut ấm 37˚C, theo dõi từ 7 đến 10 ngày.
Kiểm tra tạp nhiễm nấm: mẫu nguyên dịch được ria cấy trên môi
trường thạch Sabouraud. Theo dõi 14 ngày ở nhiệt độ phòng (từ 20˚C đến 25˚C).
MT Mẫu Thioglyconate Trypticase đậu tƣơng Thạch máu Saboraud agar Kết luận Ống 1 Ống 2 Ống 1 Ống 2 Ống 1 Ống 2 Ống 1 Ống 2 Lô... Lô... Lô...
- Đọc kết quả: mẫu nguyên dịch được xem là đạt tiêu chuẩn khi không có bất cứ tạp khuẩn nấm mốc nào mọc trên môi trường kiểm tra trong thời gian theo dõi.
trường canh thang PPLO và trên đĩa thạch PPLO có bổ sung huyết thanh ngựa và chất chiết nấm men. Theo dõi môi trường lỏng trong 14 ngày ở nhiệt độ từ 33˚C đến 37˚C. Tại các thời điểm 3 ngày, 7 ngày, 10 ngày, 14 ngày, lấy canh khuẩn ở môi trường lỏng ria cấy vào môi trường thạch PPLO. Ủ trong tủ ấm 37˚C có 5% khí CO2, theo dõi trong 28 ngày.
- Đọc kết quả: mẫu được xem là đạt khi không có khuẩn lạc Mycoplasma mọc trên môi trường kiểm tra.
3.5.5. Phƣơng pháp xác định chỉ số TCID50
- Xác định trị số TCID50 (liều gây nhiễm 50% tế bào nuôi cấy) bằng phương pháp chuẩn độ virut trên dịch treo tế bào theo Spearman và Karber. Phương pháp tóm tắt như sau:
- Dùng môi trường pha loãng virus theo cơ số 10 trong hộp pha mẫu, mỗi mẫu pha loãng từ 10-1 10-7
- Đĩa tế bào 96 giếng: có tế bào Marc-145 phát triển tốt, phủ kín 100% diện tích đáy, tế bào đã bám chắc. Rửa 2- 3 lần bằng môi trường chuẩn độ không huyết thanh hoặc dung dịch Hank +.
- Nhỏ mẫu đã pha loãng vào giếng của đĩa tế bào (100l/giếng). Mỗi nồng độ gây nhiễm vào một dãy 5 giếng. Lặp lại 2 lần
- Dùng pipet man 200 l và đầu tuýp nhựa vô trùng để nhỏ, mỗi nồng độ thay 1 đầu tuýp mới (có thể sử dụng 1 đầu tuýp cho 1 mẫu, khi đó phải nhỏ từ nồng độ loãng hơn cho đến nồng độ đặc)
- Đĩa chuẩn độ nuôi trong tủ ấm 36,5oC; 5%C02
- Kết quả hiệu giá virus được tính theo công thức Karber :
0,5 log 50 N S D L TCID Trong đó :
- L là log của độ pha loãng cao nhất có 100% có số giếng huỷ hoại.
- D là sự chênh lệch log giữa các độ pha loãng mẫu, ở đây do pha loãng bậc 100,5 nên D = 0,5.
- S là tổng số giếng huỷ hoại ở các độ pha loãng không có 100% số giếng huỷ hoại.
3.5.6. Phƣơng pháp xử lý số liệu
- Kết quả theo dõi thí nghiệm và kết quả hiệu giá virus thu thập được nhập vào EXCEL: sử dụng hàm SUM: tính tổng, hàm AVERAGE tính trung bình, STDEV.P tính độ lệch chuẩn.
- Sử dụng phần mềm MINITAB để thiết kế và phân tích dữ liệu thí nghiệm: sử dụng ANOVA để phân tích phương sai, kiểm tra phân phối chuẩn.
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH NUÔI CẤY TẾ BÀO MARC-145 TRÊN HỆ THỐNG MICROCARRIER HỆ THỐNG MICROCARRIER
4.1.1. Xác định tốc độ khuấy thích hợp để nuôi tế bào Marc-145 trên hệ thống Microcarrier
Tốc độ khuấy nhanh hay chậm đều ảnh hưởng tới sự bám và phát triển tế bào trên bề mặt của các hạt Cytodex. Mặt khác, trong môi trường nuôi tế bào hay môi trường duy trì tế bào sau nhiễm đều có chứa một lượng huyết thanh nhất định khi tốc độ khuấy không thích hợp sẽ tạo ra bọt gây hiện tượng môi trường trào lên nắp ảnh hưởng đến vô trùng trong bình nuôi và sự phát triển của tế bào nên tìm ra được độ khuấy thích hợp là rất cần thiết.
Để lựa chọn tốc độ khuấy thích hợp nuôi cấy tế bào Marc-145 trên hệ thống Microcarrier, thí nghiệm được thực hiện với 4 tốc độ khuấy: 20, 40, 60, 80 (vòng/phút). Thí nghiệp lặp lại 3 lần, điều kiện nuôi cấy tế bào giống nhau và theo dõi chỉ tiêu: khả năng lắng hạt Cytodex, khả năng tạo bọt của môi trường nuôi và hằng ngày lấy mẫu theo dõi sự phát triển của tế bào trên hạt Cytodex.
Kết quả theo dõi được trình bày bảng 4.1:
Bảng 4.1. Kết quả theo dõi điều chỉnh tốc độ khuấy Chỉ tiêu theo dõi Tốc độ khuấy (vòng/phút)
20 40 60 80
Khả năng lắng
hạt lắng hạt nhanh lắng hạt không lắng không lắng Tạo bọt môi trƣờng không tạo bọt không tạo bọt không tạo bọt tạo bọt Độ bám tế bào (%) 24h 5-10% 5-10% 10-20% 10-20% 48h 30-40% 30-40% 40-50% 40-50% 72h 60-70% 50-60% 80-90% 70-80% 96h 80-90% 80-90% 100% 100% Kết quả điều chỉnh tốc độ khuấy cho thấy: Điều chỉnh tốc độ khuấy từ 20 vòng/phút đến 60 vòng/phút môi trường nuôi không tạo bọt tuy nhiên ở tốc độ khuấy 20 vòng/phút và 40 vòng/phút các hạt Cytodex bị lắng xuống đáy bình
nhanh còn ở tốc độ khuấy 60 vòng/phút không bị lắng các hạt Cytodex xuống đáy bình. Ở tốc độ khuấy 80 vòng/phút các hạt Cytodex không bị lắng nhưng môi trường nuôi tạo bọt.
(1) (2)