Từ các kết quả đếm số tế bào bảng 4.6 và tỉ suất nhân tế bào Marc-145 hình 4.5, Tế bào Marc-145 đầu vào là 15x106TB/1,5 gram Cytodex cho tỉ xuất nhân tế bào là cao nhất (tăng 42 lần so với tế bào đầu vào). Kết quả phù hợp với nghiên cứu tỉ suất nhân tế bào trên hệ thống chai Tflask khi nghiên cứu về đặc tính sinh sản của tế bào Marc-145.
Dưới đây là một số hình ảnh nuôi tế bào Marc-145 trên hệ thống Microcarrier sau 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ và 96 giờ.
(1) (2)
(3) (4) Hình 4.6. Mức độ bám tế bào Marc-145 trên hạt Cytodex (1)24giờ nuôi, (2) 48 giờ nuôi. (3) 72 giờ nuôi, (4) 96 giờ nuôi
Kết quả nghiên cứu trên, lựa chọn tế bào đầu vào là 15x106TB/1,5 Gram Cytodex tương đương với 300x106TB/30gram hạt Cytodex cho hệ thống Microcarrier 10 lít. Kết quả này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của (A Ryan Ryan 2005)
4.2. NGHIÊN CỨU TÍNH THÍCH ỨNG CỦA VIRUS TAI XANH NUÔI CẤY TRÊN TẾ BÀO MARC-145 BẰNG HỆ THỐNG MICROCARRIER 4.2.1. Xác định thời gian hấp phụ virus vào tế bào, xử lí dịch hấp phụ virus
thuộc hoàn toàn vào bộ máy tổng hợp của tế bào. Muốn nhân virus lên thì virus phải được tế bào cho phép và xâm nhập vào tế bào. Sự hấp phụ virus là virus gắn vào thụ thể (receptor) đặc hiệu nằm trên màng sinh chất của tế bào chủ, sự hấp phụ xảy ra tốt nhất ở 37˚C.
Để xác định thời gian hấp phụ virus vào tế bào sao cho sự xâm nhập và nhân lên của virus cho hiệu giá virus cao nhất, thích hợp nhất chúng tôi thí nghiệm trên 4 thời gian hấp phụ virus: không hấp phụ, hấp phụ 30 phút, 60 phút và 90 phút. Ngoài ra dịch hấp phụ virus cũng được tiến hành hút sau khi hấp phụ hoặc không hút sau khi hấp phụ.
Kết quả theo dõi bệnh tích tế bào (CPE) để xác định được thời gian hấp phụ virus tối ưu nhất được trình bày bảng 4.7.
Bảng 4.7. Khả năng gây bệnh tích tế bào trong thời gian hấp phụ virus Thời Thời gian Hút dịch hấp phụ (%) Không hút dịch hấp phụ (%) 30 phút 60 phút 90 phút 0 phút 30 phút 60 phút 90 phút 24 0 0 0 0 0 0 0 36 0 0 0 0 0 0 5 48 10 10 20 10 10-20 20 20 60 30 30 50-60 30 30 50 50 72 40-50 50-60 70 50-60 60 70 70 Chú thích:
Tính theo % tế bào bong khỏi hạt Cytodex so với tổng số hạt Cytodex trên một vi trường (ước lượng bằng mặt thường khi soi trên kính hiển vi soi nổi)
Bệnh tích tế bào (CPE) xuất hiện sớm nhất ở 36 giờ sau gây nhiễm và sau 48 giờ gây nhiễm thấy rõ hơn. Tế bào có hiện tượng bong ra khỏi hạt Cytodex ra ngoài môi trường nuôi. Sau 60-72 giờ gây nhiễm tế bào bong ra khỏi hạt nhiều và có thế quan sát rõ hơn trên kính hiển vi soi nổi. Kết quả bệnh tích tế bào cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu trên chai Tflask (Nguyễn Thị Minh Hường 2015)
Ở các thời gian hấp phụ virus khác nhau đều cho bệnh tích tế bào sau 48 giờ khoảng 10-20%. Tuy nhiên, hấp phụ virus 90 phút và không hút dịch hấp phụ xuất hiện bệnh tích tế bào sớm hơn sau 36 giờ gây nhiễm bệnh tích khoảng 5%. Khoảng thời gian sau 72 giờ gây nhiễm, bệnh tích tế bào bong nhiều, môi trường giảm pH nhanh. Hấp phụ virus và không hút dịch hấp phụ bệnh tích gây bong nhiều hơn (60-70%) so với hấp phụ virus và hút dịch hấp phụ (50-60%).
Lấy mẫu xác định hiệu giá virus và thu được kết quả ở bảng 4.8:
Bảng 4.8. Kết quả hiệu giá xác định thời gian hấp phụ virus vào tế bào Thời gian Thời gian hấp phụ virus (phút) Hút dịch hấp phụ (log10 TCID50/ml) Không hút dịch hấp phụ (log10 TCID50/ml) 0 5,53 ±0,05 30 5,17±0,17 6,80 ±0,08 60 7,07 ±0,05 7,33 ±0,15 90 7,20 ±0,08 7,30 ±0,08
Từ kết quả bảng 4.8 cho thấy thời gian hấp phụ virus có ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển, nhân lên của virus cũng như mức độ biệu hiện bệnh tích tế bào, hiệu giá virus. Trong cùng thời gian hấp phụ virus nhưng ở bình hút dịch hấp phụ virus cho hiệu giá virus thấp hơn ở các bình không hút dịch hấp phụ virus từ 0,5- 1,0 log10TCID50/ml.
Hút dịch hấp phụ virus: Hấp phụ 30 phút sau 72 giờ gây nhiễm bệnh tích tế bào khoảng 40-50% cho kết quả xác định hiệu giá virus thấp nhất giao động từ 4,9-5,3 log10 TCID50/ml trung bình 5,17 log10TCID50/ml. Hấp phụ 60 phút sau 72 giờ gây nhiễm, hiệu giá virus giao động từ 6,9-7,1 log10TCID50/ml, kết quả xác định hiệu giá trung bình 7,07 log10TCID50/ml. Hấp phụ 90 phút sau 72 giờ gây nhiễm, hiệu giá virus giao động từ 7,1-7,3 log10TCID50/ml. Kết quả xác định hiệu giá trung bình đang cao nhất 7,20 log10TCID50/ml.
Không hút bỏ dịch hấp phụ: không hấp phụ virus và hấp phụ virus 30 phút sau 72 giờ gây nhiễm bệnh tích tế bào khoảng 50-60% thu được kết quả hiệu giá virus thấp nhất trung bình 5,53-6,80 log10TCID50/ml và tăng 1,63 log10TCID50/ml tức tăng 42 lần so với hấp phụ 30 phút hút dịch hấp phụ. Hấp phụ 60 phút và 90 phút bệnh tích tế bào sau 72 giờ gây nhiễm khoảng 70%, kết quả xác định hiệu giá giao động 7,1-7,5log10TCID50/ml. Hiệu giá trung bình 7,3-7,33 log10TCID50/ml và tăng 1,0 log10TCID50/ml so với hút dịch hấp phụ.
Kết quả trên cho thấy rằng hiệu giá virus cao nhất là hấp phụ virus 60 phút -90 phút và không hút dịch hấp phụ. Tuy nhiên trong sản xuất quy mô công nghiệp việc rút ngắn thời gian và giảm các thao tác, tránh tạp trùng trong quá trình sản xuất là rất cần thiết.
Kết quả các lô thí nghiệm trên hệ thống Microcarrier cũng cho kết quả tương tự với các thí nghiệm trước đây trên chai Tflask đã thực hiện (7,1-7,3 log10TCID50/ml), nên kết quả càng có độ tin tưởng cao.
Qua phân tích kết quả trên, lựa chọn hấp phụ virus Tai Xanh vào tế bào Marc-145 là 60 phút, không hút bỏ dịch hấp phụ cho các thí nghiệm tiếp theo.
4.2.2. Xác định môi trƣờng duy trì sau gây nhiễm virus
Môi trường duy trì tế bào sau nhiễm là môi trường nuôi tế bào có ít hoặc không có huyết thanh động vật. Môi trường duy trì có tác dụng duy trì sự sinh trưởng ổn định của tế bào tạo điều kiện tối ưu cho quá trình xâm nhập và nhân lên của virus.
Để tìm ra loại môi trường duy trì tế bào trong quá trình gây nhiễm virus đạt hiệu giá virus cao nhất khi thu hoạch. Tiến hành thử nghiệm trên 4 công thức môi trường: MEM, DMEM, M119 và LH. Tuy nhiên, sự duy trì sinh trưởng tế bào bị ảnh hưởng bởi hàm lượng huyết thanh và pH môi trường. Tất các công thức môi trường thí nghiệm chúng tôi bổ sung 1%FBS, pH=7,3±0,1.
Thí nghiệm được thực hiện 3 lần với các điều kiện nuôi tế bào, phương pháp gây nhiễm, thông số tối ưu giống nhau.
Kết quả theo dõi khả năng gây bệnh tích tế bào được thể hiện ở bảng 4.9.
Bảng 4.9. Khả năng gây bệnh tích tế bào trên các môi trƣờng Thời gian theo dõi
Môi trƣờng nuôi cấy
M199 DMEM MEM LH
24h môi trƣờng màu đỏ hồng
CPE (%) CPE 0%, tế bào bám hạt Cytodex 100%
30h môi trƣờng màu đỏ hồng
CPE (%) CPE 0%, tế bào bám hạt Cytodex 100%
48h
môi trƣờng Đỏ cam Đỏ Đỏ cam Đỏ
CPE
(% Bong) 5-10 0 5-10 0
54h
môi trƣờng đỏ cam hồng đỏ cam đỏ cam
CPE
(% Bong) 20-30 10-20 30-40 10-20
72h
môi trƣờng cam đỏ cam vàng cam Cam
CPE
Qua bảng 4.9 theo dõi mức độ biểu hiện CPE cho thấy sau 24-30 giờ gây nhiễm virus tất cả các môi trường nhiễm đều chưa gây bệnh tích tế bào. Bệnh tích tế bào xuất hiện sớm nhất sau 48 giờ gây nhiễm ở môi trường MEM và M199 khoảng 5-10%. Sau 54 giờ gây nhiễm virus, số lượng tế bào bong khỏi hạt Cytodex được thể hiện rõ, từng loại môi trường nhiễm có độ bong khác nhau, bong nhiều nhất là môi trường MEM (bong 40%). Sau 72 giờ sau nhiễm, sự thay đổi màu sắc môi trường và độ bong rõ rệt hơn
Màu sắc môi trường từ đỏ đến vàng : DMEM > LH > M199 > MEM Độ bong: MEM > M199 > DMEM > LH
Sau 72 giờ gây nhiễm virus, tiến hành thu kháng nguyên và đông tan 2 lần để giải phóng virus, lấy mẫu và chuẩn độ xác định hiệu giá. Kết quả xác định hiệu giá virus được thể hiện dưới bảng 4.10:
Bảng 4.10. Hiệu giá virus tìm môi trƣờng sau gây nhiễm Lô thí nghiệm
Hiệu giá virus (log10TCID50/ml) Lô 01 Lô 02 Lô 03 Môi trƣờng gây nhiễm DMEM 6,70 ±0,09 7,10 ±0,16 6,83 ±0,07 M199 7,23 ±0,05 7,63 ±0,09 7,43 ±0,09 LH 6,23 ±0,16 6,77 ±0,05 6,70 ±0,08 MEM 7,57 ±0,09 7,63 ±0,09 7,43 ±0,09 Kết quả xác định hiệu giá virus cho thấy trong cùng điều kiện nuôi cấy tế bào ở môi trường nuôi nhiễm MEM kết quả xác định hiệu giá virus cao nhất 7,54 log10TCID50/ml, môi trường nhiễm M199 cho kết quả xác định hiệu giá virus 7,43 log10TCID50/ml, môi trường nhiễm DMEM cho kết quả xác định hiệu giá virus 6,90 log10TCID50/ml và môi trường nhiễm LH kết quả xác địn hiệu virus giá thấp nhất là 6,54 log10TCID50/ml.
Kết quả xác định hiệu giá virus cũng phù hợp với mức độ bong tế bào trên hạt Cytodex quan sát trên kính hiển vi trong quá trình theo dõi thí nghiệm.
Môi trường MEM cũng là môi trường duy trì tế bào trong quá trình gây nhiễm cho kết quả xác định hiệu giá virus cao nhất trên chai Tflask 225cm2 theo các nghiên cứu trước đây, đồng thời cũng là môi trường đang sử dụng trong sản xuất nguyên dịch Tai Xanh. Hiệu giá virus trung bình trên hệ thống Tflask trong
khoảng 106,7-107,1TCID50/ml.
Phân tích dữ liệu trên MINITAB/ANOVA/One-way (phụ lục 1). Kết quả P ≤0,0001 chứng tỏ các môi trường nuôi khác nhau có ảnh hưởng đến kết quả xác định hiệu giá virus. Môi trường MEM và M199 trong cùng 1 nhóm A chứng tỏ có thể sử dụng 1 trong 2 môi trường này để nuôi nhiễm virus Tai Xanh.
Theo kết quả nghiên cứu trên hệ thống Microcarrier, chúng tôi thấy rằng trên cùng môi trường nuôi tế bào Marc-145 là MEM 5%FBS + Kháng sinh và môi trường nhiễm virus Tai Xanh là MEM 1%FBS + kháng sinh đang cho kết quả xác định hiệu giá virus Tai Xanh cao hơn trên hệ thống chai phẳng Tflask từ 0,2-0,5log10.
Từ kết quả thu được trong quá trình nghiên cứu trên, chúng tôi lựa chọn môi trường MEM 1%FBS là môi trường nuôi nhiễm virus Tai Xanh vào tế bào Marc-145 cho sản xuất kháng nguyên Tai Xanh.
4.2.3. Xác định liều gây nhiễm, thời gian thu hoạch virus thích hợp.
Để xác định liều gây nhiễm thích hợp cho kết quả xác định hiệu giá virus cao nhất, tiến hành gây nhiễm virus Tai Xanh trên hệ thống Microcarrier chứa một lớp tế bào Marc-145 với 4 liều gây nhiễm (MOI- Multiplicity of infection) lần lượt 0,2MOI; 0,1MOI; 0,01MOI; 0,001MOI. Mỗi liều MOI thí nghiệm/1 bình Microcarrier, tiến hành theo dõi mức độ biểu hiện bệnh tích tế bào, lấy mẫu xác định hiệu giá virus Tai Xanh sau 48 giờ, 54 giờ, 72 giờ và 96 giờ gây nhiễm.
Thí nghiệm lặp lại 3 lần và cố định cách thực hiện và thông số:
Thời gian ủ virus Tai xanh vào tế bào Marc-145: 60 phút ở 37˚C, 5% CO2 Môi trường nuôi nhiễm là MEM 1%FBS + kháng sinh
Cài đặt các thống số hệ thống: Tốc độ khuấy: 60vòng/phút, lưu lượng khí: 0,5lít/phút, giá trị DO=50%.
Bảng 4.11. Kết quả theo dõi mức độ thể hiện CPE ở các liều gây nhiễm Thời gian Thời gian
gây nhiễm virus Liều gây nhiễm virus (MOI)
0,2 0,1 0,01 0,001 Bệnh tích Tế bào (%) 24 0 0 0 0 48 30-40 10 10 0 54 50-60 30-40 30-40 10 72 70-80 70-80 60-70 30-40 96 100 100 100 50-60
Hàng ngày quan sát tế bào để đánh giá mức độ bệnh tích tế bào (CPE) ở các liều gây nhiễm và thời gian gây nhiễm khác nhau. Mức độ biểu hiện CPE được đánh giá bảng 4.11.
Qua bảng theo dõi mức độ biểu hiện CPE ta thấy sau 24 giờ gây nhiễm virus Tai Xanh tất cả các liều virus nhiễm đều chưa biểu hiện bệnh tích tế bào và bệnh tích tế bào thể hiện nhanh và mạnh dần cùng với sự tăng của liều nhiễm virus. Bệnh tích tế bào thể hiện rõ và mạnh nhất ở liều 0,1MOI và 0,01MOI. Sau 48 giờ gây nhiễm virus mới bắt đầu xuất hiện bệnh tích tế bào và sau 96 giờ thì hầu như tế bào bong hoàn toàn khỏi hạt Cytodex và thảm tế bào.
24h 48h
72h 96h
Hình 4.7. Bệnh tích tế bào 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ và 96 giờ sau gây nhiễm virus Tai xanh
Mỗi thời điểm theo dõi, tiến hành lấy mẫu soi bệnh tích tế bào và xác định hiệu giá virus để so sánh giữa các liều gây nhiễm, thời gian thu hoạch virus. Kết quả được trình bày bảng 4.12
Bảng 4.12. Kết quả xác định hiệu giá virus của các liều gây nhiễm (MOI) Thời gian
gây nhiễm virus
Liều gây nhiễm virus (MOI)
0,2 0,1 0,01 0,001
Hiệu giá virus (log10TCID50/ml)
48 7,26±0,08 7,14±0,08 6,61±0,14 4,72±0,11
54 6,57±0,05 6,54±0,08 7,19±0,11 5,83±0,16
72 5,72±0,18 6,1±0,06 7,54±0,08 6,32±0,22
96 5,06±0,23 4,94±0,23 6,82±0,13 7,14±0,08
Qua bảng kết quả xác định hiệu giá virus bảng 4.12. Hiệu giá virus Tai Xanh có sự khác biệt giữa các liều nhiễm virus khác nhau và thời gian nuôi nhiễm.
Ở liều gây nhiễm 0,2MOI và 0,1MOI sau 48 giờ gây nhiễm cho kết quả xác định hiệu giá virus đạt cao nhất, trung bình là 7,26 log10TCID50/ml và sau 54 giờ gây nhiễm virus cho kết quả xác định hiệu giá bắt đầu giảm, theo dõi đến 96 giờ sau nhiễm cho kết quả xác định hiệu giá virus còn 5,06 log10TCID50/ml giảm 2,2 log10TCID50/ml tức 158 lần.
Ở liều gây nhiễm 0,01MOI hiệu giá virus tăng dần theo thời gian gây nhiễm, kết quả xác định hiệu giá đạt cao nhất sau 72 giờ gây nhiễm (7,54 log10TCID50/ml), sau 96 giờ nuôi nhiễm kết quả xác định hiệu giá virus bắt đầu giảm dần. Kết quả này giống với các kết quả nghiên cứu đã được công bố (Nguyễn Thị Lan và cs., 2016)
Ở liều gây nhiễm 0,001MOI, mức độ thể hiện bệnh tích tế bào thấp hơn so với các liều gây nhiễm khác nên kết quả xác định hiệu giá virus thấp và cao nhất sau 96 giờ gây nhiễm (6,14 log10TCID50/ml).
Sau khi đã xác định được liều gây nhiễm virus Tai Xanh thích hợp, chúng tôi tiến hành nghiên cứu thời gian thu hoạch virus để có kết quả xác định hiệu giá virus cao nhất. Liều 0,01MOI theo quy trình và thông số hệ thống đã nghiên cứu, virus được theo dõi và thu hoạch ở các thời điểm lần lượt là 24 giờ; 36 giờ; 48
giờ; 60 giờ; 72 giờ; 84 giờ; 96 giờ; 108 giờ và 120 giờ sau gây nhiễm. Xác định hiệu giá virus tại các thời điểm thu hoạch và kết quả thu được hình 4.8.
Hình 4.8. Đồ thị sinh trƣởng và phát triển virus Tai Xanh
Qua hình 4.8 cho thấy chu kỳ sinh trưởng phát triển của virus Tai Xanh tương đối ổn định. Sau gây nhiễm 24 giờ virus bắt đầu quá trình sinh trường phát triển, hàm lượng virus thu được tăng dần theo thời gian nhiễm và đạt kết quả xác định hiệu giá cao nhất (7,2- 7,5 log10TCID50) khoảng thời gian 72-84 giờ sau gây nhiễm. Sau 96 giờ, kết quả xác định hiệu giá virus bắt đầu giảm. Điều này có thể giải thích như sau: Khi virus xâm nhập vào tế bào sau 24 giờ virus bắt đầu quá trình sinh trưởng thì cũng là lúc virus bắt đầu gây những ảnh hưởng bất lợi cho tế bào. Sự phát triển của virus càng mạnh thì tế bào càng bị ảnh hưởng nghiêm trọng và dẫn đến phá hủy tế bào. Khi kết quả xác định hiệu giá virus đạt cao nhất tại thời điểm 72-84 giờ sau gây nhiễm thì cũng là lúc tế bào bị phá hủy hoàn toàn. Khi tế bào bị phá hủy hoàn toàn thì virus không còn kí chủ kí sinh, hay nói cách khác là tế bào không còn môi trường thuận lợi để phát triển và phải tồn tại ở