PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.5.1. Phương pháp quan sát các triệu chứng lâm sàng
Quan sát triệu chứng lâm sàng, chụp ảnh, ghi chép số liệu từng cá thể, toàn đàn và thu thập mẫu (Swabs khí quản, mẫu máu (thu huyết thanh), mẫu gà nếu con vật chết hoặc có triệu chứng điển hình).
3.5.2. Phương pháp mổ khám
Gà mắc ORT được cố định trên bàn mổ hoặc khay mổ, mổ khám theo trình tự từ trên xuống dưới, bộc lộ các cơ quan để quan sát, tìm ra những biến đổi bệnh tích đại thể; lưu lại các hình ảnh bệnh tích đặc trưng.
3.5.3. Phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu
Các mẫu được lấy theo quy định.
Mẫu cơ quan tổ chức cần lấy đúng (lấy đúng cơ quan, đúng vùng tổn thương điển hình), lấy đủ (đủ thành phần cấu tạo cần nghiên cứu và đủ lượng cấn thiết).
Mẫu có thể là dịch mũi, dịch hầu họng và dịch khí quản và dịch phế quản của gà mắc bệnh ở mọi lứa tuổi. Ta có thể lấy mẫu theo phương pháp sau:
- Đối với dịch mũi và dịch ngoáy hầu họng dùng tăm bông vô trùng lấy dịch mũi, hầu họng của gà bệnh đã được lau sạch bằng cồn 70° để một thời gian cho dịch mũi thấm vào tăm bôn. Để tăm bông vào ống nghiệm chứa môi trường vận chuyển (Stuart TranspORT Medium), môi trường nước thịt vô trùng hoặc dung dịch PBS (dung dịch muối đệm phosphat), đậy nút và ghi nhãn rồi đưa về phòng thí nghiệm sau 2 - 8h; các cơ quan hoặc bộ phận ngâm trong formon 10% để làm tiêu bản bệnh lý. Nếu ở xa phòng thí nghiệm thì môi trường vận chuyển phải để ở tủ lạnh. Sau vận chuyển bệnh phẩm phải được cấy vào môi trường phân lập thích hợp.
- Đối với dịch khí quản hay dịch phế quản: dùng kéo vô trùng cắt dọc khí quản hay phế quản, sau đó dùng tăm bông vô trùng đưa dọc theo đường ống để lấy dịch. Đặt tăm bông vào trong môi trường như trên, đậy nút ghi nhãn và vận chuyển về phòng thí nghiệm.
- Với mẫu là tổ chức phổi: sau khi mổ khám gà, dùng kéo vô trùng cắt lấy tổ chức phổi ở vùng định xét nghiệm cho và túi zip và bảo quản tương tự như trên.
3.5.4. Phương pháp nuôi cấy và phân lập vi khuẩn
Mẫu bệnh phẩm được nuôi cấy trên môi trường thạch máu Columbia Blood Aagar Base (CBA) đã bổ sung 10μg/ml gentamycin hoặc bổ sung 5μg/ml gentamycin và polymycin B, ủ 37°C, 5% CO2, ở điều kiện hiếu khí trong thời gian 24 - 48 giờ.
Lựa chọn khuẩn lạc nghi ngờ cấy chuyển sang môi trường tương tự hoặc tăng sinh trên môi trường Brain Heart Broth (BHB) để thử một số đặc tính sinh hóa: Catalase; Oxidase; Kovac’s/Indol; một số phản ứng lên men đường: Sucrose, Lactose, Glucose…; phản ứng phân giải Urê…
Phản ứng thử Oxydase: tiến hành trên giấy được tẩm dung dịch Oxidase (Remel). Dùng que cấy vô trùng cấy khuẩn lạc từ môi trường thạch dàn đều trên mặt giấy đã thấm thuốc thử. Nếu thấy xuất hiện màu tím đen (giấy đổi màu có thể màu xanh) sau 10 giây là phản ứng dương tính. Nếu không xuất hiện màu tím đen hay giấy không đổi màu là phản ứng âm tính.
Phản ứng Catalase: dùng que cấy vô trùng lấy khuẩn lạc từ môi trường thạch đặt lên một điểm trên phiến kính sạch, nhỏ một giọt dung dịch oxy già (H2O2 3%) lên, trộn đều. Nếu có hiện tượng sủi bọt là phản ứng dương tính, nếu không thấy sủi bọt là phản ứng âm tính. ORT có phản ứng Catalase âm tính
Phản ứng Indol: dùng để phát hiện vi khuẩn có enzym trytophanasa chuyển hóa trypton thành indol. Cấy vi khuẩn vào nước trypton và ủ ở 37ºC/ 24 giờ. Nhỏ vài giọt thuốc thử Kovac’s, phản ứng dương tính có vòng màu đỏ cánh sen nổi lên trên (do indol kết hợp với p-dimethylaminnobelzal dehyde trong thuốc thử Kovac’s), nếu không có màu hoặc màu vàng là phản ứng âm tính.
Phản ứng phân giải Urê: phát hiện enzym ureasa phân giải urea thành amonia và cacbodioxide. Amonia sinh ra làm kiềm hóa môi trường. Cấy vi khuẩn vào canh thang ure, ủ 37ºC/ 24- 48 giờ. Phản ứng dương tính: môi trường có màu tím đỏ; phản ứng âm tính: không màu...
3.5.5. Phương pháp PCR
Chiết tách DNA từ mẫu bệnh phẩm hoặc từ canh khuẩn theo Kit QIAamp DNA Mini Kit của Hãng QIAGEN.
Mồi Trình tự PCR Ghi chú
OR16S-F1 GAG AATTAATTTACG GATTAAG
784bp Van và Hafez, 1999 OR16S-R1 TTC GCT TGG TCT CCG AAG AT Thành phần phản ứng: Stt Môi trường Thể tích (μl) 1 Nuclease-Free Water 6,5 2 Master Mix 12,5 3 Reverse Primer 0,5 4 Forward Primer 0,5 5 DNA 5 Tổng 25 Chu trình nhiệt:
Stt Nhiệt độ (°C) Thời gian (s) Chu kỳ
1 95 120 1 2 95 90 35 3 50 60 4 72 60 5 72 600 1
Sản phẩm PCR có độ dài 784bp được điện di trên Gel 1,2% trong môi trường TBE 1X.
3.5.6. Phương pháp ELISA
Sử dụng bộ kit IDEXX ELISA xác định hàm lượng kháng thể kháng ORT có trong máu của gà thu thập được và tiến hành theo các bước sau:
Để bộ kít ELISA ra ngoài ở nhiệt độ từ 18-26°C trước khi thí nghiệm, sau đó tiến hành theo các bước sau:
Bước 1: Phủ kháng nguyên lên đĩa và đánh dấu lại vị trí các mẫu trên đĩa;
Bước 2: Nhỏ 100μl đối chứng âm vào 2 giếng;
Bước 3: Nhỏ 100μl đối chứng dương vào 2 giếng;
Bước 4: 100μl mẫu vào từng giếng thích hợp;
Bước 6: Loại bỏ toàn bộ dung dịch trong giếng, nhỏ vào mỗi giếng 350μl dung dịch rửa, để 3-5 giây sau đó làm khô;
Bước 7: Nhỏ 100μl Conjugate vào mỗi giếng;
Bước 8: Ủ đĩa ở nhiệt độ từ 18-26°C trong thời gian 30±2 phút;
Bước 9: Loại bỏ toàn bộ dung dịch trong giếng, nhỏ vào mỗi giếng 350μl
dung dịch rửa, để 3-5 giây, sau đó làm khô;
Bước 10: Nhỏ 100μl dung dịch chỉ thị màu TMB vào mỗi giếng;
Bước 11: Ủ đĩa ở nhiệt độ từ 18-26°C trong thời gian 15±1 phút;
Bước 12: Nhỏ 100μl dung dịch dùng phản ứng vào mỗi giếng;
Bước 13: Đọc kết quả dưới bước sóng 650nm, A(650);
Bước 14: Tính kết quả;
- Giá trị đối chứng âm trung bình (NC) = [NC1 A(650) + NC2 A(650)]/2; - Giá trị đối chứng dương trung bình (PC) = [PC1 A(650) + PNC2 A(650)]/2;
Ghi chú: phản ứng hợp cách khi: PCtb - NCtb > 0,075; NCtb ≤ 0,150;
- S/P = [Tb mẫu A(650) - NCtb]/(PCtb - NCtb);
Bước 15: Đọc kết quả.
Nếu S/P ≤ 0,40 (phản ứng âm tính); nếu S/P > 0,40 phản ứng dương tính.
3.5.7. Phương pháp làm tiêu bản bệnh lý
Từ những mẫu bệnh phẩm có các biến đổi đại thể được lấy mẫu ngâm trong formol 10% trung tính để làm tiêu bản vi thể. Cần tiến hành làm tiêu bản để xác định bệnh tích vi thể chủ yếu của bệnh. Phương pháp làm tiêu bản vi thể theo quy trình tẩm đúc bằng parafin, nhuộm Haematoxilin – Eosin (HE). Các bước của quá trình làm tiêu bản vi thể như sau:
- Cố định bệnh phẩm: ngâm miếng tổ chức vào dung dịch formol 10%. - Vùi bệnh phẩm và đúc block: đúc mẫu bệnh phẩm trong parafin. - Cắt dán mảnh và cố định tiêu bản
- Nhuộm tiêu bản
3.5.8. Phương pháp xác định các chỉ tiêu huyết học
Phân tích các chỉ tiêu hệ hồng cầu và bạch cầu bằng máy Celldyn-3700 tại phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Sinh học Thú Y, Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam
3.5.9. Phương pháp thử kháng sinh đồ
Sử dụng phương pháp khuếch tán trên thạch để thử nghiệm khả năng mẫn cảm của vi khuẩn ORT với 14 loại kháng sinh:
+ kanamycin (30μg), + streptomycin (10μg), + ceptiofur (20/10μg), + ampicillin (10μg), + erythromycin (15μg), + doxycycline (30μg), + tetracycline (30μg), + norfloxacin (10μg), + colistin (10μg), + lincomycin (10μg), + flofenicol (30μg), + enrofloxacin (50μg), + tylosin (50μg), + tiamulin (100μg)
Ghi chú: Các loại kháng sinh trên do công ty Nam Khoa sản xuất.
Kết quả được tính dựa trên tiêu chuẩn của CLSI (2012) áp dụng đối với những vi khuẩn khó mọc.
3.5.10. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu được ghi chép và lưu trong file excel. Các tỉ lệ, số trung bình và độ lệnh chuẩn được tính toán trong phần mềm Excel, Microsoft Windows, phiên bản 7.0.