PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN LẬP
4.1.2. Kết quả nghiên cứu xây dựng quy trình chẩn đoán vi khuẩn bằng
phương pháp nuôi cấy và phân lập vi khuẩn
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã thử nghiệm 03 quy trình phân lập khác nhau gồm:
Quy trình 1: môi trường thạch máu cừu hoặc máu thỏ không bổ sung
kháng sinh gentamycin;
Quy trình 2: môi trường thạch máu cừu hoặc máu thỏ bổ sung 5μg/ml
gentamycin và polymyxin B;
Quy trình 3: môi trường thạch máu cừu hoặc máu thỏ được bổ sung
4.1.2.1. Kết quả nghiên cứu thử nghiệm quy trình phân lập 1
Kết quả thử nghiệm quy trình phân lập 1 được lặp lại 3 lần với tổng số 89 mẫu và được thể hiện ở hình 4.1.
Hình 4.1. Kết quả phân lập vi khuẩn ORT trên môi trường không gentamycin gentamycin
Kết quả hình 4.1 cho thấy: sau 24 giờ nuôi cấy trên môi trường thạch máu không bổ sung gentamycin, các vi khuẩn ngoại lai đã phát triển rất nhanh, xâm lấn toàn bộ diện tích môi trường nuôi cấy dẫn đến rất khó phát hiện khuẩn lạc nghi ngờ ORT. Mặt khác, đối với vi khuẩn ORT thời gian có thể nhận dạng khuẩn lạc khoảng 48 giờ. Với điều kiện như vậy thì sau 48 giờ toàn bộ bề mặt môi trường nuôi cấy đã bị các nhóm vi khuẩn ngoại lai phát triển và xâm lấn. Như vậy, chúng ta không thể nhận dạng đươc khuẩn lạc ORT trên môi trường nuôi cấy và phân lập nếu không bổ sung kháng sinh gentamycin vào trong môi trường.
Kết quả này là phù hợp với nghiên cứu trước đây khi cho rằng: trong các mẫu thu được, chúng thường bị nhiễm một số vi khuẩn khác như: E.coli, Proteus sp hoặc Pseudomonas sp; vì vậy, chúng thường phát triển rất nhanh và xâm lấn rộng làm cho việc xác định sự có mặt của vi khuẩn ORT rất khó khăn (Van Empel, 1997).
4.1.2.2. Kết quả nghiên cứu thử nghiệm quy trình phân lập 2
Tương tự như quy trình phân lập 1; trong quy trình này tôi cũng lặp lại 3 lần với tổng số 89 mẫu. Kết quả thu được thể hiện ở hình 4.2.
Hình 4.2. Kết quả phân lập vi khuẩn ORT trên môi trường bổ sung 5µg/ml gentamycin và polymycin B
Kết quả hình 4.2 cho thấy: sau 24 giờ nuôi cấy vi khuẩn ORT trên môi trường thạch máu có bổ sung 5µg/ml gentamycin và polymycin B, xuất hiện những khuẩn lạc nhỏ li ti, màu xám đếm xám trắng nghi ngờ ORT. Tiến hành cấy chuyển khuẩn lạc nghi ngờ trên sang môi trường tương tự hoặc sang môi trường dinh dưỡng để thực hiện các xét nghiệm tiếp theo. Như vậy, có thể bổ sung 5µg/ml gentamycin và polymycin B vào trong môi trường nuôi cấy và phân lập vi khuẩn ORT.
Kết quả nghiên cứu này là phù hợp với nghiên cứu trước đây khi cho rằng: do trong các mẫu thu được, chúng thường bị nhiễm một số vi khuẩn khác như: E.coli, Proteus sp hoặc Pseudomonas sp; vì vậy, chúng thường phát triển rất nhanh và xâm lấn rộng làm cho việc xác định sự có mặt của vi khuẩn ORT rất khó khăn. Do vậy, cần bổ sung 5μg/ml gentamycin và polymyxin B vào trong môi trường thạch máu cũng cho hiệu quả cao (Van Empel, 1997).
4.1.2.3. Kết quả nghiên cứu thử nghiệm quy trình phân lập 3
Để xây dựng được quy trình phân lập vi khuẩn ORT có độ chính xác và tin cậy cao trong quá trình phân tích và đánh giá kết quả; chúng tôi tiến hành thử nghiệm cả 3 quy trình trên cùng lượng mẫu. Kết quả nghiên cứu thử nghiệm quy trình 3 được thể hiện ở hình 4.3.
Hình 4.3. Kết quả nuôi cấy vi khuẩn ORTtrên thạch máu bổ sung 10µg/ml gentamycin
A) Đĩa sơ cấp (hình thái khuẩn lạc sau 24 giờ nuôi cấy); B) Đĩa thứ cấp (hình thái khuẩn lạc sau 48 giờ nuôi cấy)
Kết quả cho thấy: tại đĩa sơ cấp môi trường có bổ sung 10µg/ml gentamycin sau 24 giờ nuôi cấy hình thành khuẩn lạc nhỏ li ti, to bằng đầu đinh gim, có màu xám đến xám trằng nghi ORT thuần hơn, rõ ràng hơn. Tiến hành cấy chuyển khuẩn lạc nghi ngờ trên sang môi trường tương tự (hình B) hoặc môi trường giàu dinh dưỡng để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo. Như vậy, việc bổ sung 10µg/ml gentamycin vào trong môi trừơng nuôi cấy và phân lập vi khuẩn ORT cho hiệu quả cao hơn so với việc không bổ sung hoặc bổ sung 5µg/ml gentamycin và polymycin B, các khuẩn lạc phát triển tương đối độc lập và rõ ràng. Kết quả nghiên cứu cho thấy sự phù hợp so với các công bố trước đây đã chỉ ra rằng: hầu hết các chủng vi khuẩn ORT phân lập được đều kháng với kháng sinh gentamycin (Back et al., 1997).
Tổng hợp kết quả phân lập được từ quy trình trên chúng tôi thu được bảng 4.2.
Trong tổng số 89 mẫu (gà) phân lập, có 9 mẫu cho khuẩn lạc nghi ngờ của vi khuẩn ORT, chiếm 10,11% (9/89). Trong số 9 mẫu cho khuẩn lạc nghi ngờ có 6 mẫu cho kết quả dương tính với vi khuẩn ORT (đã được khẳng định bằng phản ứng PCR), chiếm tỷ lệ 66,67% (6/9).
Bảng 4.2. Kết quả phân lập vi khuẩn ORT
STT Địa điểm mẫu Số xét nghiệm Số dương Tỷ lệ (%) 1 Thái Nguyên 29 2 6,90 2 Hà Nội 18 1 5,56 3 Vĩnh Phúc 12 1 8,33 4 Thái Bình 17 1 5,88 5 Hưng Yên 8 1 12,50 6 Hải Phòng 5 0 0,00 Tổng 89 6 6,74
Nguồn: Phòng thí nghiệm trọng điểm CNSH Thú y, Khoa Thú Y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam
Kết quả bảng 4.2 cho thấy: tình hình dịch bệnh ORT đang có xu hướng lan rộng ra các tỉnh vùng phụ cận Hà Nội gồm: Thái Nguyên, Hưng Yên, Vĩnh Phúc và Thái Bình; đây đều là những địa phương có truyền thống chăn nuôi nói chung và chăn nuôi gà nói riêng. Tại Hưng Yên, tỷ lệ gà mắc ORT là cao nhất, chiếm 12,50% (1/8); tiếp đến là Vĩnh Phúc, tỷ lệ nhiễm ORT chiếm khoảng 8,33% (1/12); Thái Nguyên cũng là địa phương có tỷ lệ nhiễm ORT tương đối cao, chiếm khoảng 6,90% (2/29); Hà Nội, mặc dù là thủ đô của cả nước, nhưng tỷ lệ nhiễm vi khuẩn ORT chiếm 5,56% (1/18). Trong số 6 tỉnh chúng tôi thu thập mẫu, chỉ có Hải Phòng là địa phương không phát hiện thấy sự có mặt của ORT, chiếm 0,00% (0/5)
Kết quả bảng 4.2 cũng cho thấy: tỷ lệ nhiễm ORT trung bình tại các địa phương chúng tôi theo dõi chiếm 6,74% (6/89). Kết quả này tương đối cao so với các công bố trước đây là 4,7% (Nguyễn Thị Bích Liên và cs, 2014); 2,6% (Ozbey et al., 2005) và 2,3% (Asadpour et al., 2008). Tuy nhiên, theo một nghiên cứu khác cho rằng: khi tiến hành phân lập lại 27 trong tổng số 321 mẫu bệnh phẩm thu thập được, có 21 mẫu cho khuẩn lạc nghi ngờ ORT, chiếm 77,80% (Zahra et al., 2013).
Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy: vi khuẩn ORT phát triển tốt trên môi trường thạch có bổ sung 5% máu cừu hoặc máu thỏ, 10μg/ml gentamycin để hạn chế sự xâm lấn của một số vi khuẩn khác, nhất là E.coli, Proteus sp hoặc Pseudomonas sp nhằm cô lập được những những khuẩn lạc ORT (Van Empel, 1997) (hình 3.3). Mặt khác, các nghiên cứu chỉ ra rằng: hầu hết các chủng vi
hình thành những đám khuẩn lạc nhỏ có kích thước khác nhau, to bằng đầu đinh ghim, tròn, đục, có mầu xám đến xám trắng, rìa sắc gọn; không gây dung huyết (Zahra et al., 2013). Tuy nhiên, trong một nghiên cứu khác người ta cũng đã chỉ ra rằng: bổ sung 5μg/ml gentamycin và polymyxin B vào trong môi trường thạch máu cũng cho hiệu quả cao (Van Empel, 1997). Mặt khác, vi khuẩn không có khả năng phát triển trên môi trường thạch MacConkey (Soriano et al., 2002). Cấy chuyển khuẩn lạc sang môi trường dinh dưỡng lỏng Brain Heart Broth (BHB), sau 48 giờ nuôi cấy ở điều kiện 37°C, 5% CO2, thì môi trường đục, bề mặt môi trường hình thành một lớp váng màu trắng, khi lắc lớp váng này tan đều trong môi trường (Nguyễn Thị Lan và cs, 2016). Như vậy, chúng ta có thể áp dụng cả 2 quy trình nuôi cấy và phân lập vi khuẩn ORT vào trong việc chẩn đoán bệnh do vi khuẩn này gây nên gồm: 1) bổ sung 5μg/ml gentamycin và polymyxin B vào trong môi trường thạch máu; 2) bổ sung 10μg/ml gentamycin để hạn chế sự xâm lấn của một số vi khuẩn khác, nhất là E.coli, Proteus sp hoặc Pseudomonas sp nhằm cô lập được những những khuẩn lạc ORT.
Tiến hành kiểm tra hình thái vi khuẩn, chúng tôi nhận thấy: ORT là vi khuẩn gram âm, bắt màu hồng hoặc đỏ, có kích thước dài ngắn khác nhau (đa hình thái) (Hình 4.4). Kết quả này là phù hợp với nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng: vi khuẩn ORT là vi khuẩn gram âm, đa dạng về hình thái (kích thước vi khuẩn dài ngắn khác nhau), là vi khuẩn có dạng hình que (Zhara et al., 2013; Soriano et al 2002; Nguyễn Thị Lan và cs, 2016).
Kiểm tra đặc tính sinh hóa (Bảng 4.3) chúng tôi nhận thấy: 9/9 mẫu nghi ngờ cho phản ứng glucose dương tính, chiếm tỷ lệ 100% (9/9). Có 8/9 mẫu khuẩn lạc nghi ngờ cho phản ứng triple sugar iron agar âm tính; lysine decarboxylase và galactose dương tính, chiếm tỷ lệ khoảng 88,89% (8/9). 7/9 gốc khuẩn lạc cho phản ứng oxidase, urease, lactose, fructose dương tính; nitrate, gelatinase âm tính, chiếm 77,78% (7/9). Trong tổng số 9 gốc khuẩn lạc được kiểm tra, có 6 gốc cho phản ứng motility, catalase, Indole, MacConkey (hình 4.6), gram, sucrose âm tính, maltose dương tính, chiếm 66,67% (6/9). Kết quả này cũng phù hợp với các nghiên cứu trước đây cho rằng: vi khuẩn ORT cho phản ứng catalase, indol âm tính; phản ứng oxidase dương tính; các chủng ORT có khả năng phân giải đường fructose, galactose, glucose, lactose, maltose; không có khả năng phân giải đường sucrose và chúng có khả năng phân giải urê nhưng không có khả năng phân giải muối nitrate; không có khả năng di động và vi khuẩn không phát triển trên môi trường thạch nghiêng TSI (Soriano et al., 2002; Pan et al., 2012).
Bảng 4.3. Kết quả kiểm tra một số đặc tính sinh hóa của vi khuẩn ORT
Chỉ tiêu Đối chứng Số mẫu kiểm tra Số mẫu dương Tỷ lệ (%) Số mẫu âm Tỷ lệ (%) Glucose + 9 9 100,0 0 0,00
Triple sugar iron agar - 9 8 88,89 1 11,11
Lysine decarboxylase + 9 8 88,89 1 11,11 Galactose + 9 8 88,89 1 11,11 Oxidase + 9 7 77,78 2 22,22 Urease + 9 7 77,78 2 22,22 Nitrate - 9 7 77,78 2 22,22 Gelatinase - 9 7 77,78 2 22,22 Lactose + 9 7 77,78 2 22,22 Fructose + 9 7 77,78 2 22,22 Motility - 9 6 66,67 3 33,33 Catalase - 9 6 66,67 3 33,33 Indole - 9 6 66,67 3 33,33 Maltose + 9 6 66,67 3 33,33 MacConkey - 9 6 66,67 3 33,33 Gram - 9 6 66,67 3 33,33 Sucrose - 9 6 66,67 3 33,33
Hình 4.5. Kết quả kiểm tra phản ứng sinh hóa của ORT
A) Kết quả kiểm tra phản ứng Indol/Kovac’s;
B) Kết quả kiểm tra phản ứng Catalase; C) Kết quả kiểm tra phản ứng Oxidase
Hình 4.6. Kết quả kiểm tra tính chất mọc vủa vi khuẩn ORT trên môi trường MacConkey
A) Vi khuẩn ORT phát triển trên môi trường thạch máu Columbia; B) Vi khuẩn ORT không phát triển trên môi trường thạch MacConkey
Như vậy, việc chẩn đoán sự có mặt của vi khuẩn ORT bằng phương pháp nuôi cấy và phân lập cho độ chính xác cao và được khẳng định bằng kỹ thuật PCR. Tuy nhiên, thời gian của phương pháp này kéo dài (khoảng 7 ngày liên tiếp).
Để đánh giá độ nhạy cũng như tính hiệu quả của phương pháp nuôi cấy và phân lập vi khuẩn; chúng tôi đã tiến hành sử dụng kỹ thuật PCR và ELISA vào trong việc chẩn đoán bệnh do vi khuẩn ORT gây nên.