PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN
2.3.1. Phương pháp nuôi cấy và phân lập vi khuẩn
Khí quản, phổi và túi khí là các mô, cơ quan tốt nhất để có thể phân lập được vi khuẩn ORT. Xoang dưới hốc mắt và hốc mũi cũng là những vị trí phù hợp phục vụ cho việc nuôi cấy; nhưng, ORT dễ bị bao phủ hoặc xâm lấn bởi sự phát triển quá nhanh của các vi khuẩn khác. Nuôi cấy vi khuẩn từ máu tim và mô của gan dưới điều kiện thực tế đều cho kết quả âm tính (Hafez et al., 1993); mặc dù trước đó vi khuẩn đã được phân lập từ các cơ quan cũng như ở các khớp xương, não, buồng trứng và ống dẫn trứng sau khi gây bệnh thực nghiệm (Back et al., 1997; Van Beek et al., 1994).
ORT cũng được phân lập một cách thông thường trên môi trường thạch thường hoặc thạch chocolate. Khuẩn lạc phát triển tốt trong 24 giờ; nhưng, tốt nhất nên ủ các đĩa trong tủ ấm 37°C trong khoảng 48 - 72 giờ ở điều kiện môi trường không khí được làm giàu từ 7,5 - 10% CO2. Khuẩn lạc xuất hiện to bằng đầu đinh gim (đường kính 1 - 2mm); có màu xám đến xám trắng, mặt lồi với cạnh sắc, gọn. Nhuộm gram kết quả cho thấy: vi khuẩn ORT là gram âm, đa hình thái. Khuẩn lạc cho phản ứng catalase âm tính, phản ứng oxidase dương tính. Nuôi cấy ORT thuần khiết chúng có mùi đặc trứng, tương tự như mùi của axit butyric. Các thử nghiệm bổ sung là cần thiết để xác định các đặc tính của ORT.
Trong các mẫu thu được, chúng thường bị nhiễm một số vi khuẩn khác như: E.coli, Proteus sp hoặc Pseudomonas sp; vì vậy, chúng thường phát triển rất nhanh và xâm lấn rộng làm cho việc xác định sự có mặt của vi khuẩn ORT rất khó khăn. Do vậy, cần bổ sung 10μg/ml gentamycin môi trường thạch máu trong quá trình nuôi cấy, phân lập vi khuẩn ORT. Hoặc, bổ sung 5μg/ml gentamycin và polymyxin B vào trong môi trường thạch máu cũng cho hiệu quả cao (Van Empel, 1997). Bởi, trong các nghiên cứu trước đây người ta đã chỉ ra rằng: hầu hết các chủng vi khuẩn ORT phân lập được đều kháng với kháng sinh gentamycin (Back et al., 1997). Vi khuẩn không có khả năng phát triển trên môi trường thạch MacConkey (Soriano và cs, 2002). Mặt khác, vi khuẩn có khả năng phát triển tốt trên môi trường canh thịt có bổ sung 5% FBS (Zahra et al., 2013).
Kiểm tra ngưng kết nhanh trên phiến kính cũng được sử dụng cho mục đích chẩn đoán. Trong một nghiên cứu với 112 mẫu phân lập, tuy nhiên hiện tượng tự ngưng kết thường xuất hiện.
Kiểm tra Accelerated Graphics PORT (AGP) sử dụng kháng huyết thanh dương tính đã biết có thể được sử dụng để xác định và định typ ORT đã phân lập (Van Empel, 1997).
Một phương pháp khác được sử dụng để phát hiện các chủng phân lập nghi ngờ là PCR (Hafez et al., 1997; Hung et al., 2001; Van Empel, 1998).
2.3.2. Phát hiện kháng nguyên
PCR được sử dụng để phát hiện các ORT trong mẫu dịch khí quản được lấy từ các gà mắc bệnh nặng (Hung et al., 2001). Ngoài ra, xét nghiệm bằng miễn dịch huỳnh quang cũng đã được sử dụng để phát hiện ORT trên gà (Van Empel, 1998; Van Empel, 2000). Sau đó, Van Veen và cộng sự đã thấy rằng các xét nghiệm miễn dịch huỳnh quang và kỹ thuật peroxidase - anti peroxidase (PAP) nhạy cảm như nhau. Sử dụng các xét nghiệm này có thể xác định một tỷ lệ nhiễm ORT cao ở đàn gà thịt sau giết mổ khi so sánh với các phương pháp chẩn đoán thông thường như huyết thanh học hoặc vi khuẩn học (Van Veen et al., 2005).
2.3.3. Huyết thanh học
Huyết thanh học rất hữu dụng trong việc giám sát cũng như hỗ trợ chẩn đoán bệnh do ORT.
Các phản ứng kiểm tra ngưng kết huyết thanh trên tấm (SPAT) được sử dụng như một xét nghiệm nhanh cho việc phát hiện các kháng thể chống lại ORT (Bock et al., 1995; Erganis et al., 2002; Heeder et al., 2001). Việc chẩn đoán và giám định nhanh chóng bằng phương pháp xét nghiệm huyết thanh đem lại kết quả chính xác. SPAT được phát triển bằng cách sử dụng một chủng của ORT không phân lập từ Minnesota và báo cáo là có độ nhạy đặc biệt cao (Back et al., 1998). Tuy nhiên, trong một nghiên cứu khác (Lopes et al., 2000); SPAT chỉ phát hiện được 65% gia cầm bị nhiễm bệnh trong hai tuần đầu gây nhiễm và giảm đáng kể ở các thời gian tiếp theo. Điều này cho thấy SPAT chỉ phát hiện được kháng thể IgM, loại chỉ có khả năng gây ngưng kết với một kháng nguyên đặc hiệu. Hầu hết các SPTA chỉ phản ứng với một serotype nhất định, dù cho phản ứng chéo xảy ra (Van Empel, 1998).
ELISA đã được phát triển bằng sử dụng các serotype khác nhau và chiết tách kháng nguyên của ORT. Kháng nguyên cô đặc được sử dụng cho việc định type, có khả năng cho những kết quả chính xác nhất cho các serotype cụ thể (Van Empel et al., 1997). Ngược lại kháng thể SDS chiết tách (Hafez et al., 2000) và dịch tiết từ lớp màng protein của ORT (Lopes et al., 2000) sẽ cho kết quả nhiều phản ứng kháng chéo, cho phép phát hiện các kháng thể chống lại của nhiều serotype khác nhau trong cùng một lần xét nghiệm.Ngoài ra với việc sử dụng các phương pháp ELISA này,các chủng ORT có thể được phân biệt với các vi khuẩn gram âm khác có khả năng gây bệnh cho gia cầm và dễ lẫn với ORT (Ballagi et al., 2000; Hafez et al., 2000; Heeder et al., 2001; Refai et al., 2005, Ryll et al., 1997; Sakai et al., 2000; Turan and Ak, 2002; Van Empel et al., 1997).
Điều tra thực địa sử dụng các kỹ thuật ELISA hoặc bộ kit ELISA thương mại (VDPro® CSFV AB C-ELISA) rất hữu dụng khi theo dõi đàn gia cầm và chẩn đoán mắc ORT.
Năm 2002, người ta đã phát triển phương pháp DIA (Dot Immunobinding assay). Tuy nhiên, đây là một xét nghiệm dường như ít nhạy hơn so với các xét nghiệm ngưng kết khác (Erganis et al., 2002).
Popp và Hafez đã nghiên cứu ảnh hưởng của việc sử dụng amoxicillin trong điều trị tới động học kháng thể sau khi gây bệnh thực nghiệm. Họ nhận thấy rằng việc điều trị tức thì không ảnh hưởng đến đáp ứng miễn dịch, trong khi điều trị sau 7 ngày gây nhiễm sẽ cho một đáp ứng kháng thể thấp hơn (Popp and Hafez, 2002).
2.3.4. Chẩn đoán phân biệt
Các tổn thương do ORT trên hệ thống hô hấp khá giống với các nguyên nhân gây bệnh hô hấp khác như CRD (Bệnh hô hấp mãn tính), IC (Viêm mũi truyền nhiễm), ILT (Viêm thanh khí quản truyền nhiễm), IB (Viêm khí quản truyền nhiễm).
2.3.5. Chẩn đoán bằng phương pháp Bệnh lý
2.3.5.1. Bệnh tích đại thể
Ở gà thịt thương phẩm, các tổn thương đại thể thường gặp bao gồm: viêm phổi, viêm màng phổi và viêm túi khí. Khi giết thịt hoặc kiểm tra sau giết mổ sẽ thấy dịch dạng bọt, màu trắng, chất dịch tiết này có màu giống sữa chua và có thể
thấy rõ trong các túi khí, hầu hết các tổn thương chỉ tiến triển ở một bên thùy phổi (Van Empel et al., 1996). Các tổn thương do ORT có thể làm tỷ lệ chết tăng cao tới 50% hoặc hơn (Van Veen et al., 2000). Thêm nữa, phù thũng dưới da mặt, tại các điểm tiếp giáp có sụn gây viêm đầu, viêm xương, viêm xương tủy và viêm màng não được báo cáo thấy ở gà (Bock et al., 1995; Goovaerts et al., 1999; Soto, 1999).
Ở gà tây, có hiện tượng phù và viêm một bên phổi hoặc đối xứng 2 bên với các tơ huyết trên màng phổi. Ngoài ra, có thể có các hiện tượng viêm mủ tơ huyết gây viêm túi khí, ngoại tâm mạc, màng bao tim và khí quản. Trong một số trường hợp, gan và lách có thể sưng cũng như có sự biến đổi ở cơ tim có thể quan sát được (Hafez et al., 1993). Hiện tượng nhiễm khuẩn tại khớp, xương sống có thể bắt gặp ở gà lớn.
2.3.5.2. Bệnh tích vi thể
Hầu hết các tổn thương vi thể được gặp tại phổi, màng phổi và túi khí. Trong các ca bệnh, phổi có hiện tượng sung huyết, trong tất cả nhu mô có một lượng lớn hỗn hợp các fibrin lẫn với đại thực bào và tế bào heterophil (bạch cầu trung tính) nằm tự do trong lòng các mao mạch, phế nang và đoạn cuống phổi. Sự khuếch tán và thâm nhiễm các đại thực bào với số lượng ít hơn các tế bào heterophil.
Các ổ hoại tử lan rộng ở trung tâm các lòng cuống phổi và nhu mô lân cận. Ổ hoại tử thường chứa đầy chặt hỗn hợp của các tế bào hoại tử, heterophil thâm nhiễm hoặc chất tiết, và có thể có sự phân tán thành các cụm nhỏ của vi khuẩn. Nhiều mao mạch bị căng phồng do các cục huyết khối. Màng phổi và túi khí có thể dày lên nghiêm trọng và phù nề do lắng đọng tơ huyết ở các kẽ, sự xâm nhiễm của các tế bào bạch cầu trung tính, rải rác các ổ hoại tử nhỏ có sự thâm nhiễm của các bạch cầu trung tính và xơ hóa (Chin et al., 2008).