Khí quản, phổi và túi khí là các mô, cơ quan tốt nhất để có thể phân lập được vi khuẩn ORT. Xoang dưới hốc mắt và hốc mũi cũng là những vị trí phù hợp phục vụ cho việc nuôi cấy; nhưng, ORT dễ bị bao phủ hoặc xâm lấn bởi sự phát triển quá nhanh của các vi khuẩn khác. Nuôi cấy vi khuẩn từ máu tim và mô của gan dưới điều kiện thực tế đều cho kết quả âm tính (Hafez et al., 1993); mặc dù trước đó vi khuẩn đã được phân lập từ các cơ quan cũng như ở các khớp xương, não, buồng trứng và ống dẫn trứng sau khi gây bệnh thực nghiệm (Back et al., 1997; Van Beek et al., 1994).
ORT cũng được phân lập một cách thông thường trên môi trường thạch thường hoặc thạch chocolate. Khuẩn lạc phát triển tốt trong 24 giờ; nhưng, tốt nhất nên ủ các đĩa trong tủ ấm 37°C trong khoảng 48 - 72 giờ ở điều kiện môi trường không khí được làm giàu từ 7,5 - 10% CO2. Khuẩn lạc xuất hiện to bằng đầu đinh gim (đường kính 1 - 2mm); có màu xám đến xám trắng, mặt lồi với cạnh sắc, gọn. Nhuộm gram kết quả cho thấy: vi khuẩn ORT là gram âm, đa hình thái. Khuẩn lạc cho phản ứng catalase âm tính, phản ứng oxidase dương tính. Nuôi cấy ORT thuần khiết chúng có mùi đặc trứng, tương tự như mùi của axit butyric. Các thử nghiệm bổ sung là cần thiết để xác định các đặc tính của ORT.
Trong các mẫu thu được, chúng thường bị nhiễm một số vi khuẩn khác như: E.coli, Proteus sp hoặc Pseudomonas sp; vì vậy, chúng thường phát triển rất nhanh và xâm lấn rộng làm cho việc xác định sự có mặt của vi khuẩn ORT rất khó khăn. Do vậy, cần bổ sung 10μg/ml gentamycin môi trường thạch máu trong quá trình nuôi cấy, phân lập vi khuẩn ORT. Hoặc, bổ sung 5μg/ml gentamycin và polymyxin B vào trong môi trường thạch máu cũng cho hiệu quả cao (Van Empel, 1997). Bởi, trong các nghiên cứu trước đây người ta đã chỉ ra rằng: hầu hết các chủng vi khuẩn ORT phân lập được đều kháng với kháng sinh gentamycin (Back et al., 1997). Vi khuẩn không có khả năng phát triển trên môi trường thạch MacConkey (Soriano và cs, 2002). Mặt khác, vi khuẩn có khả năng phát triển tốt trên môi trường canh thịt có bổ sung 5% FBS (Zahra et al., 2013).
Kiểm tra ngưng kết nhanh trên phiến kính cũng được sử dụng cho mục đích chẩn đoán. Trong một nghiên cứu với 112 mẫu phân lập, tuy nhiên hiện tượng tự ngưng kết thường xuất hiện.
Kiểm tra Accelerated Graphics PORT (AGP) sử dụng kháng huyết thanh dương tính đã biết có thể được sử dụng để xác định và định typ ORT đã phân lập (Van Empel, 1997).
Một phương pháp khác được sử dụng để phát hiện các chủng phân lập nghi ngờ là PCR (Hafez et al., 1997; Hung et al., 2001; Van Empel, 1998).