3.3.1. Đối tượng nghiên cứu
Gà ISA Brown ở các lứa tuổi từ 3 - 6; 7 - 20 và trên 20 tuần tuổi mắc bệnh do vi khuẩn Ornithobacterium rhinotracheale - ORT.
3.3.2. Vật liệu nghiên cứu
- Môi trường, hóa chất:
+ Thạch Columbia Blood Aagar Base (Oxoid); + Brain Heart Broth (Merck);
+ Catalase (Việt Nam); + Oxidase (Remel); + Kovac’s/Indol (Merck);
+ Tryple Sugar Iron Agar (Merck); + Urê;
+ Bộ Kít nhuộm Gram (Merck);
+ Kit chiết tách DNA: QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN Inc., USA), + Kít ELISA (Hãng IDEXX, Thụy Sĩ);
+ Hóa chất sinh phẩm thực hiện phản ứng PCR, + Agarose,
+ Ethidium bromide, + 100bp DNA Ladder;
+ Formon 10%;
+ Kháng sinh bổ sung vào trong môi trường thạch máu: gentamycin, pholymycin B (Công ty cổ phần dược vật tư y tế Thanh Hóa)...;
- Trang thiết bị phòng thí nghiệm: + Tủ ấm CO2,
+ Cabinet vô trùng, + Máy PCR,
+ Máy điện di, + Máy đọc gel, + Máy VORTex,
+ Máy đọc kết quả ELISA, + Tủ lạnh dương,
+ Tủ lạnh âm sâu (-86°C);
+ Pipette 1000, 100, 10μl và đầu type tương ứng; + Đèn cồn, bật lửa, bông cồn, bình xịt cồn, + Que cấy, que láng,
+ Bút viết kính,
+ Đĩa petri, ống nghiệm, nút bông…;
- Dụng cụ bảo hộ lao động: Mũ, khẩu trang, găng tay, quần, áo, ủng…; - Dụng cụ lấy mẫu: Khay inox, pank, dao, kéo, kẹp, Seringe, túi Zip vô trùng, bông tăm vô trùng, bông cồn, bình xịt cồn…
3.4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
3.4.1. Nghiên cứu xây dựng quy trình phân lập vi khuẩn gây bệnh ORT 3.4.2. Xác định một số đặc điểm bệnh lý của gà ISA Brown mắc bệnh ORT 3.4.2. Xác định một số đặc điểm bệnh lý của gà ISA Brown mắc bệnh ORT
- Xác định triệu chứng lâm sàng của gà ISA Brown mắc bệnh ORT. - Xác định bệnh tích đại thể của gà ISA Brown mắc bệnh ORT. - Xác định bệnh tích vi thể của gà ISA Brown mắc bệnh ORT. - Xác định chỉ tiêu sinh lý máu của gà ISA Brown mắc bệnh ORT.
3.4.3. Xác định tính mẫn cảm của vi khuẩn ORT với một số loại kháng sinh trong phòng thí nghiệm. trong phòng thí nghiệm.
3.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.5.1. Phương pháp quan sát các triệu chứng lâm sàng
Quan sát triệu chứng lâm sàng, chụp ảnh, ghi chép số liệu từng cá thể, toàn đàn và thu thập mẫu (Swabs khí quản, mẫu máu (thu huyết thanh), mẫu gà nếu con vật chết hoặc có triệu chứng điển hình).
3.5.2. Phương pháp mổ khám
Gà mắc ORT được cố định trên bàn mổ hoặc khay mổ, mổ khám theo trình tự từ trên xuống dưới, bộc lộ các cơ quan để quan sát, tìm ra những biến đổi bệnh tích đại thể; lưu lại các hình ảnh bệnh tích đặc trưng.
3.5.3. Phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu
Các mẫu được lấy theo quy định.
Mẫu cơ quan tổ chức cần lấy đúng (lấy đúng cơ quan, đúng vùng tổn thương điển hình), lấy đủ (đủ thành phần cấu tạo cần nghiên cứu và đủ lượng cấn thiết).
Mẫu có thể là dịch mũi, dịch hầu họng và dịch khí quản và dịch phế quản của gà mắc bệnh ở mọi lứa tuổi. Ta có thể lấy mẫu theo phương pháp sau:
- Đối với dịch mũi và dịch ngoáy hầu họng dùng tăm bông vô trùng lấy dịch mũi, hầu họng của gà bệnh đã được lau sạch bằng cồn 70° để một thời gian cho dịch mũi thấm vào tăm bôn. Để tăm bông vào ống nghiệm chứa môi trường vận chuyển (Stuart TranspORT Medium), môi trường nước thịt vô trùng hoặc dung dịch PBS (dung dịch muối đệm phosphat), đậy nút và ghi nhãn rồi đưa về phòng thí nghiệm sau 2 - 8h; các cơ quan hoặc bộ phận ngâm trong formon 10% để làm tiêu bản bệnh lý. Nếu ở xa phòng thí nghiệm thì môi trường vận chuyển phải để ở tủ lạnh. Sau vận chuyển bệnh phẩm phải được cấy vào môi trường phân lập thích hợp.
- Đối với dịch khí quản hay dịch phế quản: dùng kéo vô trùng cắt dọc khí quản hay phế quản, sau đó dùng tăm bông vô trùng đưa dọc theo đường ống để lấy dịch. Đặt tăm bông vào trong môi trường như trên, đậy nút ghi nhãn và vận chuyển về phòng thí nghiệm.
- Với mẫu là tổ chức phổi: sau khi mổ khám gà, dùng kéo vô trùng cắt lấy tổ chức phổi ở vùng định xét nghiệm cho và túi zip và bảo quản tương tự như trên.
3.5.4. Phương pháp nuôi cấy và phân lập vi khuẩn
Mẫu bệnh phẩm được nuôi cấy trên môi trường thạch máu Columbia Blood Aagar Base (CBA) đã bổ sung 10μg/ml gentamycin hoặc bổ sung 5μg/ml gentamycin và polymycin B, ủ 37°C, 5% CO2, ở điều kiện hiếu khí trong thời gian 24 - 48 giờ.
Lựa chọn khuẩn lạc nghi ngờ cấy chuyển sang môi trường tương tự hoặc tăng sinh trên môi trường Brain Heart Broth (BHB) để thử một số đặc tính sinh hóa: Catalase; Oxidase; Kovac’s/Indol; một số phản ứng lên men đường: Sucrose, Lactose, Glucose…; phản ứng phân giải Urê…
Phản ứng thử Oxydase: tiến hành trên giấy được tẩm dung dịch Oxidase (Remel). Dùng que cấy vô trùng cấy khuẩn lạc từ môi trường thạch dàn đều trên mặt giấy đã thấm thuốc thử. Nếu thấy xuất hiện màu tím đen (giấy đổi màu có thể màu xanh) sau 10 giây là phản ứng dương tính. Nếu không xuất hiện màu tím đen hay giấy không đổi màu là phản ứng âm tính.
Phản ứng Catalase: dùng que cấy vô trùng lấy khuẩn lạc từ môi trường thạch đặt lên một điểm trên phiến kính sạch, nhỏ một giọt dung dịch oxy già (H2O2 3%) lên, trộn đều. Nếu có hiện tượng sủi bọt là phản ứng dương tính, nếu không thấy sủi bọt là phản ứng âm tính. ORT có phản ứng Catalase âm tính
Phản ứng Indol: dùng để phát hiện vi khuẩn có enzym trytophanasa chuyển hóa trypton thành indol. Cấy vi khuẩn vào nước trypton và ủ ở 37ºC/ 24 giờ. Nhỏ vài giọt thuốc thử Kovac’s, phản ứng dương tính có vòng màu đỏ cánh sen nổi lên trên (do indol kết hợp với p-dimethylaminnobelzal dehyde trong thuốc thử Kovac’s), nếu không có màu hoặc màu vàng là phản ứng âm tính.
Phản ứng phân giải Urê: phát hiện enzym ureasa phân giải urea thành amonia và cacbodioxide. Amonia sinh ra làm kiềm hóa môi trường. Cấy vi khuẩn vào canh thang ure, ủ 37ºC/ 24- 48 giờ. Phản ứng dương tính: môi trường có màu tím đỏ; phản ứng âm tính: không màu...
3.5.5. Phương pháp PCR
Chiết tách DNA từ mẫu bệnh phẩm hoặc từ canh khuẩn theo Kit QIAamp DNA Mini Kit của Hãng QIAGEN.
Mồi Trình tự PCR Ghi chú
OR16S-F1 GAG AATTAATTTACG GATTAAG
784bp Van và Hafez, 1999 OR16S-R1 TTC GCT TGG TCT CCG AAG AT Thành phần phản ứng: Stt Môi trường Thể tích (μl) 1 Nuclease-Free Water 6,5 2 Master Mix 12,5 3 Reverse Primer 0,5 4 Forward Primer 0,5 5 DNA 5 Tổng 25 Chu trình nhiệt:
Stt Nhiệt độ (°C) Thời gian (s) Chu kỳ
1 95 120 1 2 95 90 35 3 50 60 4 72 60 5 72 600 1
Sản phẩm PCR có độ dài 784bp được điện di trên Gel 1,2% trong môi trường TBE 1X.
3.5.6. Phương pháp ELISA
Sử dụng bộ kit IDEXX ELISA xác định hàm lượng kháng thể kháng ORT có trong máu của gà thu thập được và tiến hành theo các bước sau:
Để bộ kít ELISA ra ngoài ở nhiệt độ từ 18-26°C trước khi thí nghiệm, sau đó tiến hành theo các bước sau:
Bước 1: Phủ kháng nguyên lên đĩa và đánh dấu lại vị trí các mẫu trên đĩa;
Bước 2: Nhỏ 100μl đối chứng âm vào 2 giếng;
Bước 3: Nhỏ 100μl đối chứng dương vào 2 giếng;
Bước 4: 100μl mẫu vào từng giếng thích hợp;
Bước 6: Loại bỏ toàn bộ dung dịch trong giếng, nhỏ vào mỗi giếng 350μl dung dịch rửa, để 3-5 giây sau đó làm khô;
Bước 7: Nhỏ 100μl Conjugate vào mỗi giếng;
Bước 8: Ủ đĩa ở nhiệt độ từ 18-26°C trong thời gian 30±2 phút;
Bước 9: Loại bỏ toàn bộ dung dịch trong giếng, nhỏ vào mỗi giếng 350μl
dung dịch rửa, để 3-5 giây, sau đó làm khô;
Bước 10: Nhỏ 100μl dung dịch chỉ thị màu TMB vào mỗi giếng;
Bước 11: Ủ đĩa ở nhiệt độ từ 18-26°C trong thời gian 15±1 phút;
Bước 12: Nhỏ 100μl dung dịch dùng phản ứng vào mỗi giếng;
Bước 13: Đọc kết quả dưới bước sóng 650nm, A(650);
Bước 14: Tính kết quả;
- Giá trị đối chứng âm trung bình (NC) = [NC1 A(650) + NC2 A(650)]/2; - Giá trị đối chứng dương trung bình (PC) = [PC1 A(650) + PNC2 A(650)]/2;
Ghi chú: phản ứng hợp cách khi: PCtb - NCtb > 0,075; NCtb ≤ 0,150;
- S/P = [Tb mẫu A(650) - NCtb]/(PCtb - NCtb);
Bước 15: Đọc kết quả.
Nếu S/P ≤ 0,40 (phản ứng âm tính); nếu S/P > 0,40 phản ứng dương tính.
3.5.7. Phương pháp làm tiêu bản bệnh lý
Từ những mẫu bệnh phẩm có các biến đổi đại thể được lấy mẫu ngâm trong formol 10% trung tính để làm tiêu bản vi thể. Cần tiến hành làm tiêu bản để xác định bệnh tích vi thể chủ yếu của bệnh. Phương pháp làm tiêu bản vi thể theo quy trình tẩm đúc bằng parafin, nhuộm Haematoxilin – Eosin (HE). Các bước của quá trình làm tiêu bản vi thể như sau:
- Cố định bệnh phẩm: ngâm miếng tổ chức vào dung dịch formol 10%. - Vùi bệnh phẩm và đúc block: đúc mẫu bệnh phẩm trong parafin. - Cắt dán mảnh và cố định tiêu bản
- Nhuộm tiêu bản
3.5.8. Phương pháp xác định các chỉ tiêu huyết học
Phân tích các chỉ tiêu hệ hồng cầu và bạch cầu bằng máy Celldyn-3700 tại phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Sinh học Thú Y, Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam
3.5.9. Phương pháp thử kháng sinh đồ
Sử dụng phương pháp khuếch tán trên thạch để thử nghiệm khả năng mẫn cảm của vi khuẩn ORT với 14 loại kháng sinh:
+ kanamycin (30μg), + streptomycin (10μg), + ceptiofur (20/10μg), + ampicillin (10μg), + erythromycin (15μg), + doxycycline (30μg), + tetracycline (30μg), + norfloxacin (10μg), + colistin (10μg), + lincomycin (10μg), + flofenicol (30μg), + enrofloxacin (50μg), + tylosin (50μg), + tiamulin (100μg)
Ghi chú: Các loại kháng sinh trên do công ty Nam Khoa sản xuất.
Kết quả được tính dựa trên tiêu chuẩn của CLSI (2012) áp dụng đối với những vi khuẩn khó mọc.
3.5.10. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu được ghi chép và lưu trong file excel. Các tỉ lệ, số trung bình và độ lệnh chuẩn được tính toán trong phần mềm Excel, Microsoft Windows, phiên bản 7.0.
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN LẬP VI
KHUẨN GÂY BỆNH Ornithobacterium rhinotracheale - ORT
4.1.1. Kết quả thu thập mẫu bệnh phẩm
Mẫu bệnh phẩm được thu thập nhờ sự hợp tác giữa khoa Thú y nói chung và phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Sinh học Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam nói riêng với chi cục Thú y các tỉnh, Thành phố, giữa các Công ty thuốc thú y trong cả nước, chủ trang trại hoặc các hộ chăn nuôi gà ở một số tỉnh phía Bắc Việt Nam. Mẫu bệnh phẩm là dịch Swabs khí quản, khí quản, phổi, túi khí hoặc gà mắc ORT ở các lứa tuổi khác nhau. Kết quả thu thập mẫu được tổng hợp ở bảng 4.1.
Bảng 4.1. Kết quả thu thập mẫu bệnh phẩm gà ISA Brown mắc ORT
STT Địa điểm mẫu Số lượng mẫu (con)
Nhóm gà
3 - 6 tuần 7 - 20 tuần Trên 20 tuần 1 Thái Nguyên 29 16 8 5 2 Hà Nội 18 10 6 2 3 Vĩnh Phúc 12 5 4 3 4 Thái Bình 17 11 4 2 5 Hưng Yên 8 4 3 1 6 Hải Phòng 5 2 2 1 Tổng 89 48 27 14
Nguồn: Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Sinh học Thú y, khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
Kết quả bảng 4.1 cho thấy: các tỉnh hoặc Thành phố khác nhau thì khác nhau về lượng mẫu gà mắc ORT. Trong 6 tỉnh hoặc Thành phố trên thì Thái Nguyên là tỉnh có nhiều mẫu mắc ORT nhất, chiếm 32,58% (29/89 mẫu). Tiếp đến là Hà Nội, có 18 mẫu mắc ORT được gửi về phòng thí nghiệm, chiếm 20,22% (18/89). Kế đến là Thái Bình, có 17 mẫu gà mắc ORT trong tổng số 89 mẫu, chiếm khoảng 19,10%. Vĩnh Phúc cũng là địa phương có số lượng gà mắc
ORT tương đối nhiều được gửi về phòng thí nghiệm, chiếm 13,48% (12/89 mẫu). Địa phương có số lượng mẫu gửi về phòng thí nghiệm ít nhất là Hải Phòng, chiếm khoảng 5,62% (5/89 mẫu).
Mặt khác, kết quả bảng 4.1 cũng cho thấy: ở các lứa tuổi khác nhau thì khác nhau về nguy cơ mắc bệnh do vi khuẩn ORT gây nên. Lứa tuổi có tỷ lệ mắc ORT cao nhất là từ 3 - 6 tuần tuổi, chiếm tỷ lệ 53,93% (48/89 mẫu). Tiếp đến là lứa tuổi từ 7 - 20 tuần tuổi, chiếm khoảng 27,00% (27/89); kế đến là lứa tuổi trên 20 tuần tuổi, chiếm 29,17% (14/89). Như vậy, ở các lứa tuổi của gà đều có nguy cơ nhiễm ORT. Nhưng tỷ lệ cao nhất là nhóm tuổi từ 3 - 6 tuần tuổi. Kết quả này cũng phù hợp với các nghiên cứu trước đây khi cho rằng: bệnh ORT có thể gặp trên gà và gà tây ở mọi lứa tuổi, hay gặp nhất ở lứa tuổi gà giò và gà lớn. Gà thịt công nghiệp thường mắc ở độ tuổi từ tuần thứ 3 đến tuần thứ 6.
Gà thịt làm giống từ 20 - 50 tuần tuổi cũng bị mắc ORT, tỉ lệ nhiễm cao nhất vào thời kỳ đẻ hoặc ngay trước khi bước vào giai đoạn đẻ (Chin and Charlton, 2008; Chin et al., 2008). Gà lông màu, gà hậu bị, gà đẻ và gà giống thường mắc ở độ tuổi từ tuần thứ 6 trở đi và trong suốt quá trình đẻ trứng.
Gà thương phẩm từ 20 - 50 tuần tuổi nhiễm với tỉ lệ tử vong tăng. Ở gà tây phát hiện gà 2 tuần tuổi nhiễm O. rhinotracheal, mức độ nhiễm và tỉ lệ tử vong cao (Chin and Charlton, 2008; Chin et al., 2008), tỉ lệ tử vong thường là khoảng 1 - 15%, nhưng có thể lên đến 50%. Triệu chứng điển hình là ho, khó thở, chảy nước mắt, nước mũi (Chin et al., 2008).
4.1.2. Kết quả nghiên cứu xây dựng quy trình chẩn đoán vi khuẩn bằng phương pháp nuôi cấy và phân lập vi khuẩn phương pháp nuôi cấy và phân lập vi khuẩn
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã thử nghiệm 03 quy trình phân lập khác nhau gồm:
Quy trình 1: môi trường thạch máu cừu hoặc máu thỏ không bổ sung
kháng sinh gentamycin;
Quy trình 2: môi trường thạch máu cừu hoặc máu thỏ bổ sung 5μg/ml
gentamycin và polymyxin B;
Quy trình 3: môi trường thạch máu cừu hoặc máu thỏ được bổ sung
4.1.2.1. Kết quả nghiên cứu thử nghiệm quy trình phân lập 1
Kết quả thử nghiệm quy trình phân lập 1 được lặp lại 3 lần với tổng số 89 mẫu và được thể hiện ở hình 4.1.
Hình 4.1. Kết quả phân lập vi khuẩn ORT trên môi trường không gentamycin
Kết quả hình 4.1 cho thấy: sau 24 giờ nuôi cấy trên môi trường thạch máu không bổ sung gentamycin, các vi khuẩn ngoại lai đã phát triển rất nhanh, xâm lấn toàn bộ diện tích môi trường nuôi cấy dẫn đến rất khó phát hiện khuẩn lạc nghi ngờ ORT. Mặt khác, đối với vi khuẩn ORT thời gian có thể nhận dạng khuẩn lạc khoảng 48 giờ. Với điều kiện như vậy thì sau 48 giờ toàn bộ bề mặt môi trường nuôi cấy đã bị các nhóm vi khuẩn ngoại lai phát triển và xâm lấn. Như vậy, chúng ta không thể nhận dạng đươc khuẩn lạc ORT trên môi trường nuôi cấy và phân lập nếu không bổ sung kháng sinh gentamycin vào trong môi trường.
Kết quả này là phù hợp với nghiên cứu trước đây khi cho rằng: trong các mẫu thu được, chúng thường bị nhiễm một số vi khuẩn khác như: E.coli, Proteus sp hoặc Pseudomonas sp; vì vậy, chúng thường phát triển rất nhanh và xâm lấn rộng làm cho việc xác định sự có mặt của vi khuẩn ORT rất khó khăn (Van Empel, 1997).
4.1.2.2. Kết quả nghiên cứu thử nghiệm quy trình phân lập 2
Tương tự như quy trình phân lập 1; trong quy trình này tôi cũng lặp lại 3 lần với tổng số 89 mẫu. Kết quả thu được thể hiện ở hình 4.2.
Hình 4.2. Kết quả phân lập vi khuẩn ORT trên môi trường bổ sung 5µg/ml gentamycin và polymycin B