Bước 4: Cấy mẫu trên môi trường thạch PCA
Đối với một mẫu kiểm nghiệm phải nuôi cấy ít nhất 3 đậm độ pha loãng liên tiếp, mỗi đậm độ dùng 2 đĩa petri vô trùng. Lấy 1 ml mẫu hoặc dung dịch pha loãng ở các đậm độ khác nhau cho vào giữa từng đĩa petri. Môi trường PCA đã đun nóng chảy, để nguội đến 45 0C ± 1 0C. Rót vào từng đĩa 12 ml đến 15 ml môi trường thạch, đảo đều dung dịch mẫu với môi trường bằng cách lắc 3 lần sang phải và 3 lần sang trái. Để các đĩa thạch đông tự nhiên trên mặt phẳng mát, nằm ngang. Thời gian bắt đầu pha loãng đến khi rót môi trường vào đĩa không được quá 30 phút.
Bước 5: Nuôi cấy tủ ấm và đọc kết quả
Khi thạch đã đông, lật úp đĩa và cho vào tủ ấm 37 0C trong thời gian từ 18 giờ đến 24 giờ. Sau 24 giờ, đếm kết quả, đếm tổng số các khuẩn lạc mọc trên các đĩa thạch. Vi khuẩn Bacillus trên môi trường thạch PCA tạo thành khuẩn lạc màu trắng, hình dạng thay đổi. Chọn những đĩa có từ 15 khuẩn lạc đến 300 khuẩn lạc của 2 đậm độ pha loãng liên tiếp để tính kết quả. Nếu chênh lệch các giá trị ở 2 đậm độ nhỏ hơn hoặc bằng 2 lần.
b. Các chỉ tiêu nghiên cứu
- Tính số N bào tử cho 1 g hoặc 1 ml sản phẩm bằng cách tính trung bình cộng của tống số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa theo công thức sau:
Trong đó:
ΣC là tổng các khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa ñược giữ lại từ 2 đậm độ pha loãng tiếp theo;
V là thể tích mẫu cấy trên mỗi nĩa, tính bằng mililit (ml); n1 là số đĩa có đậm độ pha loãng thứ nhất được giữ lại; n2 là số đĩa có đậm độ pha loãng thứ hai được giữ lại; d là hệ số pha loãng tương ứng với độ pha loãng thứ nhất.
3.3.2 Ảnh hưởng của việc bổ sung sản phẩm Bacillus Weaner vào khẩu phần ăn đến một số chỉ tiêu năng suất lợn con qua các tuần tuổi
3.3.2.1. Ảnh hưởng của việc bổ sung sản phẩm Bacillus Weaner vào khẩu phần ăn đến khối lượng cơ thể lợn con qua các tuần tuổi
a. Bố trí thí nghiệm:
Dùng phương pháp phân lô so sánh: 495 lợn con giống ngoại 3 máu (Landrace – Yorshire x Duroc) của 16 ổ đẻ từ 16 nái có cùng lứa đẻ đang theo mẹ được phân làm 2 lô lặp lại 3 lần (mỗi lô 8 ổ đẻ) theo phương pháp khối ngẫu nhiên, hoàn toàn đảm bảo sự đồng đều về tuổi, khối lượng và chế độ chăm sóc quản lý.
- Lô ĐC: Tổng số lợn con được đưa vào thử nghiệm lần 1, lần 2, lần 3 lần lượt là 83, 80, 84 con được cho ăn tự do thức ăn dành cho lợn con đang sử dụng tại trại.
- Lô TN: Số lợn con thử nghiệm lần 1, lần 2, lần 3 lần lượt là 84, 81, 83. Lợn con được cho ăn tự do thức ăn dành cho lợn con có bổ sung 0,03% chế phẩm Bacillus Weaner mật số 1 x 1012 CFU/kg (300 gam/tấn thức ăn) trộn đều vào khẩu phần khi phối trộn công thức.
Sau khi cai sữa ở tuần tuổi thứ 4, tức là 28 ngày tuổi, để đảm bảo tính dồng đều về khối lượng và tỷ lệ đực cái, mỗi lần thử, mỗi lô chọn 75 con được nhốt ở hai ô chuồng (một ô 37 con và một lô 38 con) với ba lần lặp lại (tổng số lợn thí nghiệm là 225 con/lô) theo phương pháp khối ngẫu nhiên, đảm bảo sự sự
đồng đều về tuổi, giới tính khối lượng và chế độ chăm sóc quản lý. Lợn con ở lô ĐC được cho ăn thức ăn dành cho lợn con cai sữa trại đang sử dụng, còn ở lô TN được cho ăn thức ăn dành cho lợn con cai sữa có bổ sung 0,03% chế phẩm Bacillus Weaner mật số 1 x 1012 CFU/kg (300 gam/tấn thức ăn) trộn đều vào khẩu phần khi phối trộn công thức.
Bảng 3.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Phân lô
Số lượng lợn thí nghiệm Tổng Lô 1 – ĐC (con) Lô 2 - TN (con) (con)
Từ sơ sinh đến 4 tuần tuổi (24 ổ đẻ) (24 ổ đẻ)
Lần 1 83 84 167
Lần 2 80 81 181
Lần 3 84 83 167
Tổng 247 248 495
Từ 5 đến 8 tuần tuổi (6 chuồng) (6 chuồng)
Lần 1 75 75 150
Lần 2 75 75 150
Lần 3 75 75 150
Tổng 225 225 450
Giai đoạn lợn con từ sơ sinh đến 4 tuần tuổi lợn con được chia làm 24 ổ đẻ ở lô TN và 24 ổ đẻ ở lô ĐC. Giai đoạn từ 5 đến 8 tuần tuổi lợn con được chia làm 6 chuồng ở lô TN và 6 chuồng ở lô ĐC.
Tất cả các lợn con đưa vào nuôi thử nghiệm ở các lô được xác định khối lượng đầu vào bằng cân đồng hồ để xác định khối lượng đầu vào và bấm thẻ tai để theo dõi trong quá trình thử nghiệm.
Khối lượng cơ thể được xác định hàng tuần bằng cân đồng hồ, lượng thức ăn cho ăn, thức ăn dư thừa được cân và xác định hàng ngày.
Thức ăn thí nghiệm được phối hợp khẩu phần cơ sở bằng phần mềm Brill Formulation – USA.
Bảng 3.2. Khẩu phần dinh dưỡng cơ sở cho thí nghiệm
Lợn con từ 7 – 28 ngày Lợn con từ 29 – 56 ngày
Tỷ lệ khẩu phần, % ĐC TN ĐC TN
Ngô ép đùn, % 30,00 30,00 20,59 20,59
Khô đậu tương 46%CP 18,40 18,40 20,89 20,89
Gạo tấm, % 8,46 8,46 15,00 15,00 Lúa mỳ, % 10,00 10,00 14,50 14,50 PreLac, % 5,00 5,00 10,00 10,00 Lactose 70% 13,14 13,14 9,14 9,14 Bột huyết tương, % 3,00 3,00 - - Plasma Protein, % 3,00 3,00 - - Bột cá 60% CP 3,00 3,00 3,00 3,00 DCP 18.5% 0,45 0,45 0,83 0,83 Premix Piglets, % 0,25 0,25 0,25 0,25 Dầu thực vật, % 2,30 2,30 3,00 3,00 Muối, % 0,08 0,08 0,19 0,19 Phụ gia khác, % 2,92 2,89 2,61 2,58 Colistin, ppm 100 - - - Amoxicillin, ppm - - 100 - Probiotic, % - 0,03 - 0,03 Tổng 100.00 100.00 100.00 100.00 Thành phấn dinh dưỡng DM, % 90,20 90,20 88,36 88,36 ME, kcal/kg 3.350 3.350 3.334 3.334 CP, % 20,50 20,50 18,50 18,50 Crude fat, % 5,90 5,90 6,40 6,40 Crude fiber, % 2,02 2,02 2,08 2,08 Crude ash, % 1,80 1,80 1,80 1,80 Ca, % 0,81 0,81 0,90 0,90 Total P, % 0,69 0,69 0,72 0,72 Lysine, % 1,50 1,50 1,45 1,45 Methionine, % 0,50 0,50 0,54 0,54 Met+Cys, % 0,89 0,89 0,87 0,87
b. Chỉ tiêu nghiên cứu:
- Khối lượng lợn qua các tuần tuổi (kg/con): cân riêng từng cá thể trước khi cho ăn:
+ Giai đoạn từ sơ sinh đến ngày thứ 28: sử dụng cân điện tử 20kg, sai số ± 10g + Giai đoạn từ ngày 28 đến ngày thứ 56: sử dụng cân điện tử 50kg, sai số ± 100g + Toàn bộ lợn sẽ được cân buổi sáng trước khi cho ăn vào một ngày cố định trong tuần.
3.3.2.2. Ảnh hưởng của việc bổ sung sản phẩm Bacillus Weaner vào khẩu phần ăn đến tăng khối lượng trung bình (ADG) lợn con qua các tuần tuổi.
a. Bố trí thí nghiệm:
- Cân khối lượng từng lợn con thí nghiệm ở những thời điểm xác định và định mức tăng khối lượng hằng ngày của lợn con trong thời gian tiến hành thí nghiệm. Ghi chép lại để tính toán xác định tăng khối lượng trung binh (ADG) ở lợn con.
b. Chỉ tiêu nghiên cứu:
- Tăng khối lượng trung bình (ADG) (g/con/ngày): của lợn con qua các tuần tuổi
Trong đó:
ADG: tăng khối lượng trung bình (g/con/ngày) W1: khối lượng cơ thể tại thời điểm T1(g) W2: khối lượng cơ thể tại thời điểm T2 (g) T1, T2: thời điểm cân lần trước và lần sau
3.3.2.3. Ảnh hưởng của việc bổ sung sản phẩm Bacillus Weaner vào khẩu phần ăn đến lượng thức ăn thu nhận(ADFI) lợn con qua các tuần tuổi
a. Bố trí thí nghiệm:
Bố trí thí nghiệm như nội dung 3.3.2.
- Cân lượng thức ăn cho ăn, lượng thức ăn còn thừa để tính lượng thức ăn thu nhận. Từ đó xác định lượng thức ăn thu nhận (ADFI) của lợn con.
ADG = W2 – W1
b. Chỉ tiêu nghiên cứu:
- Lượng thức ăn thu nhận - ADFI (gam/con/ngày):
3.3.2.4. Ảnh hưởng của việc bổ sung sản phẩm Bacillus Weaner vào khẩu phần ăn đến hiệu quả chuyển hóa thức ăn(FCR) lợn con qua các tuần tuổi
a. Bố trí thí nghiệm:
Bố trí thí nghiệm như nội dung 3.3.2.
b. Chỉ tiêu nghiên cứu
- Hiệu quả chuyển hóa thức ăn (FCR (kgTA/kgTT): Hàng ngày cân
lượng thức ăn cho ăn, lượng thức ăn còn thừa để tính lượng thức ăn thu nhận. Tiêu tốn thức ăn/kg tăng khối lượng được tính theo công thức:
3.3.3. Ảnh hưởng của việc bổ sung sản phẩm Bacillus Weaner vào khẩu phần ăn đến tỷ lệ tiêu chảy và tỷ lệ chết của lợn con qua các giai đoạn phần ăn đến tỷ lệ tiêu chảy và tỷ lệ chết của lợn con qua các giai đoạn
a. Bố trí thí nghiệm
Bố trí thí nghiệm như nội dung 3.3.2.
- Ghi chép chính xác số lượng lợn con tiêu chảy, số ngày tiêu chảy và số lợn con chết. Từ đó xác định tỷ lệ tiêu chảy, tỷ lệ chết.
b. Chỉ tiêu nghiên cứu
Theo dõi, thống kê ghi chép đầy đủ chính xác số lượng lợn con chết của các ô chuồng trong thời gian thí nghiệm.
- Tỷ lệ chết:
Tỷ lệ chết (%) = Số con chết (con) x 100
Tổng số lợn trong đàn (con)
ADFI = Lượng thức ăn cho ăn (g) – Lượng thức ăn thừa (g) x 100 Số lợn thí nghiệm (con)
FCR (kg TA/kgTT) = Tổng lượng thức ăn thu nhận (kg)
- Tỷ lệ mắc tiêu chảy (%): theo dõi, thống kê ghi chép những lợn con bị tiêu chảy trong đàn và số ngày mắc tiêu chảy.
Tỷ lệ mắc tiêu chảy (%) = Tổng số ngày mắc tiêu chảy (ngày) x 100 Tổng số ngày nuôi (ngày)
3.3.4. Ảnh hưởng của việc bổ sung sản phẩm Bacillus Weaner vào khẩu phần ăn đến sức khỏe đường tiêu hóa lợn con phần ăn đến sức khỏe đường tiêu hóa lợn con
3.3.4.1. Ảnh hưởng của việc bổ sung sản phẩm Bacillus Weaner vào khẩu phần ăn đến thay đổi hệ vi sinh vật đường ruột lợn con
Những lợn con ở các lô tiến hành lấy mẫu ở các đoạn ruột không tràng, hồi tràng, manh tràng, kết tràng và trực tràng ở các giai đoạn 28, 56 ngày tuổi, mỗi lô tiến hành mổ lấy 6 mẫu từ 3 con đực và 3 con cái có kích thước, khối lượng trung bình so với toàn đàn để kiểm tra mật số các vi sinh vật. Các chỉ tiêu vi sinh vật đường ruột xác định gồm: tổng số Coliform, E.coli, Samonella,
Clostridium perfringens, Lactobacillus spp. theo các bước sau:
- Xác định Coliform theo tiêu chuẩn ISO 4832/2006
Cấy mẫu trên môi trường thạch thường: Đối với một mẫu kiểm nghiệm phải nuôi cấy ít nhất 3 đậm độ, mỗi đậm độ dùng 2 đĩa petri và 1 pipet vô khuẩn riêng. Lấy 1 ml sản phẩm (lỏng) hoặc dung dịch pha loãng ở những đậm độ khác nhau cho vào giữa từng đĩa petri. Rót vào từng đĩa 12 – 15 ml môi trường thạch, trộn đảo đều dung dịch mẫu và môi trường bằng cách lắc sang phải và sang trái mỗi chiều 3 lần. Để các đĩa thạch đông tự nhiên trên mặt ngang. Thời gian từ khi bắt đầu pha loãng mẫu đến khi rót môi trường không được quá 30 phút.
Nuôi cấy trong tủ ấm và đọc kết quả: Khi thạch đã đông, lật sấp các đĩa petri và để vào tủ ấm ở nhiệt độ 30 ± 10C từ 48 đến 72 giờ. Sau 48 giờ tính kết quả sơ bộ bằng cách đếm những khuẩn lạc đã mọc trên các đĩa nuôi cấy, sau 72 giờ tính kết quả chính thức. Chọn tất cả các đĩa có không quá 300 khuẩn lạc để tính kết quả.
- Xác định E.coli theo tiêu chuẩn TCVN7924-2:2008 (ISO 16649-2 : 2001) Cấy mẫu trên môi trường thạch TBX: Dùng micropipet vô trùng chuyển 1 ml mẫu thử pha loãng ban đầu (10-1) vào đĩa Petri vô trùng. Cấy vào 2 đĩa petri ở mỗi độ pha loãng. Lặp lại quy trình trên cho các dung dịch pha loãng thập phân tiếp theo, sử dụng một pipet mới vô trùng cho mỗi độ pha loãng.
Rót vào mỗi đĩa petri khoảng 15 ml môi trường TBX mà trước đó đã được làm nguội đến khoảng từ 44 oC đến 47 oC trên nồi cách thủy.
Trộn cẩn thận dịch cấy với môi trường và để yên cho hỗn hợp đông lại, để các đĩa petri trên mặt phẳng mát nằm ngang. Thời gian tính từ khi phân phối dịch cấy vào đĩa đến khi rót môi trường không được quá 15 phút.
Nuôi cấy tủ ấm và đọc kết quả: Lật ngược các đĩa và để vào tủ ấm để ở 44
oC trong khoảng từ 18 giờ đến 24 giờ. Tổng thời gian ủ không được quá 24 giờ. Sau giai đoạn ủ ấm quy định, đếm các CFU điển hình của Escherichia coli dương tính β-glucuronidaza trên mỗi đĩa thạch chứa ít hơn 150 CFU điển hình và ít hơn 300 CFU tổng số (điển hình và không điển hình).
Vi khuẩn ở nhiệt độ 44 oC hình thành các khuẩn lạc màu xanh điển hình trên môi trường TBX, dương tính β-glucuronidaza (β-glucuronidase-positive
Escherichia coli).
- Xác định Salmonella theo tiêu chuẩn ISO 6579/2003
Cấy ria trên bề mặt nghiêng của thạch và cấy đâm sâu xuống đáy. Ủ ở 37 °C ± 1 °C trong 24 h ± 3 h.
Diễn giải những thay đổi trong môi trường như sau: + Cấy đâm sâu
Màu vàng: glucoza dương tính (sử dụng glucoza.
Màu đỏ hoặc không đổi màu: glucoza âm tính (không sử dụng glucoza..
Màu đen: sinh hydro sunfua.
Bọt hoặc vết rạn: sinh khí từ glucoza. + Bề mặt nghiêng của thạch
Màu vàng: lactoza dương tính.
Màu đỏ hoặc không đổi màu lactoza và sucroza âm tính (không sử dụng lactoza cũng như không sử dụng sucroza.
Các khuẩn lạc Salmonella điển hình thể hiện tính kiềm (màu đỏ) trên bề mặt nghiêng của thạch và khi cấy đâm sâu mang tính axit (màu vàng) có sinh khí (bọt khí) và (với khoảng 90 % trường hợp) sinh hydrosunfua (thạch bị đen) .
Khi Salmonella dương tính với lactoza được phân lập, thì trên bề mặt nghiêng của thạch TSI có màu vàng. Do vậy, việc khẳng định sơ bộ các chủng Salmonella không chỉ dựa trên các kết quả của phép thử trên thạch TSI
- Xác định Clostridium perfringen theo tiêu chuẩn TCVN 4991:2005 (ISO 7937/2004)
Cấy mẫu trên môi trường thạch SC: Dùng micropipette vô trùng cho vào mỗi đĩa 1 ml mẫu đã pha loãng cho vào chính giữa hai đĩa petri vô trùng. Rót vào mỗi đĩa 10 ml đến 15 ml thạch SC, được duy trì ở 44 °C đến 47 °C trong nồi cách thủy và trộn đều chất cấy bằng cách xoay nhẹ từng đĩa. Khi môi trường đã đông đặc lại thì phủ kín thêm một lớp dày 10 ml của cùng loại thạch SC.
Nuôi cấy tủ ấm và đọc kết quả: Để cho đông đặc lại. Đặt các đĩa vào các bình môi trường cải biến hoặc các vật đựng thích hợp khác và ủ trong các điều kiện kỵ khí ở 37 °C trong 20 ± 2 giờ.
Sau giai đoạn ủ qui định, chọn tất cả các đĩa chứa ít hơn 150 khuẩn lạc. Từ các đĩa này, chọn các đĩa đại diện cho các độ pha loãng liên tiếp, nếu có thể. Đếm các khuẩn lạc điển hình của C.perfringens trên mỗi đĩa.
Vi khuẩn C.perfringens trên môi trường thạch SC, hình thành các khuẩn lạc điển hình (kết tủa đen, do khử sunfit thành sunfua, làm cho màu khuẩn lạc bị đen).
- Xác định Lactobacillus spp theo tiêu chuẩn TCVN 8737:2011
Cấy mẫu trên môi trường thạch MRS: Đối với một mẫu kiểm nghiệm phải nuôi cấy ít nhất 3 đậm độ pha loãng, mỗi đậm độ dùng 2 đĩa petri vô trùng. Lấy 1 ml mẫu hoặc dung dịch pha loãng ở các đậm độ khác nhau cho vào giữa từng đĩa petri. Môi trường MRS thạch đã tan chảy, để nguội đến 45 0C ± 1 0C. Rót vào từng đĩa 12 ml đến 15 ml môi trường thạch, đảo đều dung dịch mẫu với môi trường bằng cách lắc 3 lần sang phải và 3 lần sang trái. Để các đĩa thạch đông tự nhiên trên mặt phẳng mát, nằm ngang. Thời gian bắt đầu pha loãng đến khi rót môi trường vào đĩa không được quá 30 phút.
Nuôi cấy tủ ấm và đọc kết quả: Khi thạch đã đông, lật úp đĩa và cho vào tủ ấm 5 % CO2, ở 37 0C trong thời gian từ 24 đến 72 giờ. Nếu không có tủ ấm CO2, có thể tạo điều kiện yếm khí để nuôi cấy bằng cách: sau khi các đĩa thạch đã