Phần 3 Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu
3.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
3.1.1. Địa điểm nghiên cứu
- Trang trại chăn nuôi lợn Nguyễn Văn Thu. Địa chỉ: Xã Hoàng Lâu – Huyện Tam Dương – Tỉnh Vĩnh Phúc.
- Phòng thí nghiệm, Bộ môn Giải Phẩu – Tổ Chức, Khoa Thú Y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
- Phòng thí nghiệm, Bộ môn Ký sinh trùng, Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
3.1.2. Thời gian nghiên cứu
- Thời gian: thí nghiệm từ 01/12/2016 đến 15/07/2017. 3.2. ĐỐI TƯỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
3.2.1. Đối tượng nghiên cứu
- Lợn con theo mẹ từ 1 đến 28 ngày tuổi, số lượng 495 lợn con, giống 3 máu (Landrace x Yorshire - Duroc).
- Lợn con cai sữa 29 đến 56 ngày tuổi, số lượng 450 lợn con, giống 3 máu (Landrace x Yorshire - Duroc).
3.2.2. Vật liệu nghiên cứu
- Chế phẩm Bacillus Weaner do công ty BioSpring sản xuất.
Thành phần của sản phẩm: Tổng số bào từ Bacillus ≥1 x 1012CFU/kg
+ Bào tử Bacillus subtilis HU58……≥4 x 1011CFU/kg
+ Bào tử Bacillus coagulans………..≥3 x 1011CFU/kg
+ Bào tử Bacillus licheformis………≥3 x 1011CFU/kg. 3.3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.1. Kiểm tra tỷ lệ bảo toàn số lượng bào tử Bacillus sau quá trình ép viên thức ăn thức ăn
a. Bố trí thí nghiệm
Năm mẫu thức ăn cho lợn con sau ép viên được lấy tại nhà máy ngay sau khi sản xuất và gửi về phòng thí nghiệm trong 24 giờ. Các mẫu thức ăn được phân tích, kiểm tra số lượng bào tử Bacillus theo TCVN 8736:2011.
Các bước tiến hành phân tích mẫu kiểm tra số lượng vi khuẩn Bacillus
trong mẫu thức ăn có bổ sung chế phẩm PBW: Bước 1: Chuẩn bị dung dịch pha loảng mẫu
Cân 9 g NaCl, hòa tan trong nước cất đựng trong bình định mức 1000 ml, chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng là 7,0 ± 0,2 bằng dung dịch HCl 0,1 N và NaOH 0,1 N. Dùng ống đong cho vào bình nón mỗi bình 90 ml và dùng pipet lấy cho vào ống nghiệm mỗi ống 9 ml dung dịch trên. Đậy bằng nút bông không thấm nước, có giấy bạc, hấp tiệt trùng ở nhiệt độ 121 0C trong 15 phút. Bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 2 đến 8 0C, sử dụng trong 15 ngày.
Bước 2: Chuẩn bị môi trường nuôi cấy
Cân các thành phần môi trường PCA (Pepton 5,0 g, cao nấm men 2,5 g, D(+)-Glucose 1,0 g, Thạch 14,0 g, Nước cất 1000 ml), chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng là 7,0 ± 0,2 bằng dung dịch HCl 0,1 N và NaOH 0,1 N. Lắc đều và ñun cách thủy hoặc trong lò vi sóng đến khi sôi (môi trường trong). Rót vào bình 250 ml lượng môi trường 100 ml. Tiệt khuẩn trong nồi hấp ở nhiệt độ 121
0C trong 15 phút. Nếu môi trường sử dụng ngay, để nguội ñến 45 0C ± 1 0C ở bể điều nhiệt, nếu chưa sử dụng ngay thì cần bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ từ 2 ñến 8 0C không quá 30 ngày.
Bước 3: Chuẩn bị mẫu phân tích và pha loãng mẫu
Cân vô trùng khoảng 10 g (10 ml), chính xác đến 0,1 mg, mẫu thử cho vào bình nón đựng 90 ml dung dịch pha loãng đã tiệt trùng được độ pha loãng 10-1. Cho lên máy lắc đồng hoá mẫu khoảng 30 phút. Đặt trong bể điều nhiệt 80 0C trong 10 phút.
Dùng micropipet lấy 1 ml dịch pha loãng 10-1 từ bình nón mẫu đã đồng hóa cho vào ống nghiệm chứa 9ml dung dịch pha loãng đã tiệt trùng được độ pha loãng 10-2. Tiếp tục pha loãng tương tự đến độ pha loãng 10-5, 10-6, 10-7, 10-8 để đếm được từ 15 khuẩn lạc đến 300 khuẩn lạc trên đĩa thạch.
Hình 3.1. Pha loàng mẫu từ 10-1 đến 10-5Bước 4: Cấy mẫu trên môi trường thạch PCA Bước 4: Cấy mẫu trên môi trường thạch PCA
Đối với một mẫu kiểm nghiệm phải nuôi cấy ít nhất 3 đậm độ pha loãng liên tiếp, mỗi đậm độ dùng 2 đĩa petri vô trùng. Lấy 1 ml mẫu hoặc dung dịch pha loãng ở các đậm độ khác nhau cho vào giữa từng đĩa petri. Môi trường PCA đã đun nóng chảy, để nguội đến 45 0C ± 1 0C. Rót vào từng đĩa 12 ml đến 15 ml môi trường thạch, đảo đều dung dịch mẫu với môi trường bằng cách lắc 3 lần sang phải và 3 lần sang trái. Để các đĩa thạch đông tự nhiên trên mặt phẳng mát, nằm ngang. Thời gian bắt đầu pha loãng đến khi rót môi trường vào đĩa không được quá 30 phút.
Bước 5: Nuôi cấy tủ ấm và đọc kết quả
Khi thạch đã đông, lật úp đĩa và cho vào tủ ấm 37 0C trong thời gian từ 18 giờ đến 24 giờ. Sau 24 giờ, đếm kết quả, đếm tổng số các khuẩn lạc mọc trên các đĩa thạch. Vi khuẩn Bacillus trên môi trường thạch PCA tạo thành khuẩn lạc màu trắng, hình dạng thay đổi. Chọn những đĩa có từ 15 khuẩn lạc đến 300 khuẩn lạc của 2 đậm độ pha loãng liên tiếp để tính kết quả. Nếu chênh lệch các giá trị ở 2 đậm độ nhỏ hơn hoặc bằng 2 lần.
b. Các chỉ tiêu nghiên cứu
- Tính số N bào tử cho 1 g hoặc 1 ml sản phẩm bằng cách tính trung bình cộng của tống số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa theo công thức sau:
Trong đó:
ΣC là tổng các khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa ñược giữ lại từ 2 đậm độ pha loãng tiếp theo;
V là thể tích mẫu cấy trên mỗi nĩa, tính bằng mililit (ml); n1 là số đĩa có đậm độ pha loãng thứ nhất được giữ lại; n2 là số đĩa có đậm độ pha loãng thứ hai được giữ lại; d là hệ số pha loãng tương ứng với độ pha loãng thứ nhất.
3.3.2 Ảnh hưởng của việc bổ sung sản phẩm Bacillus Weaner vào khẩu phần ăn đến một số chỉ tiêu năng suất lợn con qua các tuần tuổi
3.3.2.1. Ảnh hưởng của việc bổ sung sản phẩm Bacillus Weaner vào khẩu phần ăn đến khối lượng cơ thể lợn con qua các tuần tuổi
a. Bố trí thí nghiệm:
Dùng phương pháp phân lô so sánh: 495 lợn con giống ngoại 3 máu (Landrace – Yorshire x Duroc) của 16 ổ đẻ từ 16 nái có cùng lứa đẻ đang theo mẹ được phân làm 2 lô lặp lại 3 lần (mỗi lô 8 ổ đẻ) theo phương pháp khối ngẫu nhiên, hoàn toàn đảm bảo sự đồng đều về tuổi, khối lượng và chế độ chăm sóc quản lý.
- Lô ĐC: Tổng số lợn con được đưa vào thử nghiệm lần 1, lần 2, lần 3 lần lượt là 83, 80, 84 con được cho ăn tự do thức ăn dành cho lợn con đang sử dụng tại trại.
- Lô TN: Số lợn con thử nghiệm lần 1, lần 2, lần 3 lần lượt là 84, 81, 83. Lợn con được cho ăn tự do thức ăn dành cho lợn con có bổ sung 0,03% chế phẩm Bacillus Weaner mật số 1 x 1012 CFU/kg (300 gam/tấn thức ăn) trộn đều vào khẩu phần khi phối trộn công thức.
Sau khi cai sữa ở tuần tuổi thứ 4, tức là 28 ngày tuổi, để đảm bảo tính dồng đều về khối lượng và tỷ lệ đực cái, mỗi lần thử, mỗi lô chọn 75 con được nhốt ở hai ô chuồng (một ô 37 con và một lô 38 con) với ba lần lặp lại (tổng số lợn thí nghiệm là 225 con/lô) theo phương pháp khối ngẫu nhiên, đảm bảo sự sự
đồng đều về tuổi, giới tính khối lượng và chế độ chăm sóc quản lý. Lợn con ở lô ĐC được cho ăn thức ăn dành cho lợn con cai sữa trại đang sử dụng, còn ở lô TN được cho ăn thức ăn dành cho lợn con cai sữa có bổ sung 0,03% chế phẩm Bacillus Weaner mật số 1 x 1012 CFU/kg (300 gam/tấn thức ăn) trộn đều vào khẩu phần khi phối trộn công thức.
Bảng 3.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Phân lô
Số lượng lợn thí nghiệm Tổng Lô 1 – ĐC (con) Lô 2 - TN (con) (con)
Từ sơ sinh đến 4 tuần tuổi (24 ổ đẻ) (24 ổ đẻ)
Lần 1 83 84 167
Lần 2 80 81 181
Lần 3 84 83 167
Tổng 247 248 495
Từ 5 đến 8 tuần tuổi (6 chuồng) (6 chuồng)
Lần 1 75 75 150
Lần 2 75 75 150
Lần 3 75 75 150
Tổng 225 225 450
Giai đoạn lợn con từ sơ sinh đến 4 tuần tuổi lợn con được chia làm 24 ổ đẻ ở lô TN và 24 ổ đẻ ở lô ĐC. Giai đoạn từ 5 đến 8 tuần tuổi lợn con được chia làm 6 chuồng ở lô TN và 6 chuồng ở lô ĐC.
Tất cả các lợn con đưa vào nuôi thử nghiệm ở các lô được xác định khối lượng đầu vào bằng cân đồng hồ để xác định khối lượng đầu vào và bấm thẻ tai để theo dõi trong quá trình thử nghiệm.
Khối lượng cơ thể được xác định hàng tuần bằng cân đồng hồ, lượng thức ăn cho ăn, thức ăn dư thừa được cân và xác định hàng ngày.
Thức ăn thí nghiệm được phối hợp khẩu phần cơ sở bằng phần mềm Brill Formulation – USA.
Bảng 3.2. Khẩu phần dinh dưỡng cơ sở cho thí nghiệm
Lợn con từ 7 – 28 ngày Lợn con từ 29 – 56 ngày
Tỷ lệ khẩu phần, % ĐC TN ĐC TN
Ngô ép đùn, % 30,00 30,00 20,59 20,59
Khô đậu tương 46%CP 18,40 18,40 20,89 20,89
Gạo tấm, % 8,46 8,46 15,00 15,00 Lúa mỳ, % 10,00 10,00 14,50 14,50 PreLac, % 5,00 5,00 10,00 10,00 Lactose 70% 13,14 13,14 9,14 9,14 Bột huyết tương, % 3,00 3,00 - - Plasma Protein, % 3,00 3,00 - - Bột cá 60% CP 3,00 3,00 3,00 3,00 DCP 18.5% 0,45 0,45 0,83 0,83 Premix Piglets, % 0,25 0,25 0,25 0,25 Dầu thực vật, % 2,30 2,30 3,00 3,00 Muối, % 0,08 0,08 0,19 0,19 Phụ gia khác, % 2,92 2,89 2,61 2,58 Colistin, ppm 100 - - - Amoxicillin, ppm - - 100 - Probiotic, % - 0,03 - 0,03 Tổng 100.00 100.00 100.00 100.00 Thành phấn dinh dưỡng DM, % 90,20 90,20 88,36 88,36 ME, kcal/kg 3.350 3.350 3.334 3.334 CP, % 20,50 20,50 18,50 18,50 Crude fat, % 5,90 5,90 6,40 6,40 Crude fiber, % 2,02 2,02 2,08 2,08 Crude ash, % 1,80 1,80 1,80 1,80 Ca, % 0,81 0,81 0,90 0,90 Total P, % 0,69 0,69 0,72 0,72 Lysine, % 1,50 1,50 1,45 1,45 Methionine, % 0,50 0,50 0,54 0,54 Met+Cys, % 0,89 0,89 0,87 0,87
b. Chỉ tiêu nghiên cứu:
- Khối lượng lợn qua các tuần tuổi (kg/con): cân riêng từng cá thể trước khi cho ăn:
+ Giai đoạn từ sơ sinh đến ngày thứ 28: sử dụng cân điện tử 20kg, sai số ± 10g + Giai đoạn từ ngày 28 đến ngày thứ 56: sử dụng cân điện tử 50kg, sai số ± 100g + Toàn bộ lợn sẽ được cân buổi sáng trước khi cho ăn vào một ngày cố định trong tuần.
3.3.2.2. Ảnh hưởng của việc bổ sung sản phẩm Bacillus Weaner vào khẩu phần ăn đến tăng khối lượng trung bình (ADG) lợn con qua các tuần tuổi.
a. Bố trí thí nghiệm:
- Cân khối lượng từng lợn con thí nghiệm ở những thời điểm xác định và định mức tăng khối lượng hằng ngày của lợn con trong thời gian tiến hành thí nghiệm. Ghi chép lại để tính toán xác định tăng khối lượng trung binh (ADG) ở lợn con.
b. Chỉ tiêu nghiên cứu:
- Tăng khối lượng trung bình (ADG) (g/con/ngày): của lợn con qua các tuần tuổi
Trong đó:
ADG: tăng khối lượng trung bình (g/con/ngày) W1: khối lượng cơ thể tại thời điểm T1(g) W2: khối lượng cơ thể tại thời điểm T2 (g) T1, T2: thời điểm cân lần trước và lần sau
3.3.2.3. Ảnh hưởng của việc bổ sung sản phẩm Bacillus Weaner vào khẩu phần ăn đến lượng thức ăn thu nhận(ADFI) lợn con qua các tuần tuổi
a. Bố trí thí nghiệm:
Bố trí thí nghiệm như nội dung 3.3.2.
- Cân lượng thức ăn cho ăn, lượng thức ăn còn thừa để tính lượng thức ăn thu nhận. Từ đó xác định lượng thức ăn thu nhận (ADFI) của lợn con.
ADG = W2 – W1
b. Chỉ tiêu nghiên cứu:
- Lượng thức ăn thu nhận - ADFI (gam/con/ngày):
3.3.2.4. Ảnh hưởng của việc bổ sung sản phẩm Bacillus Weaner vào khẩu phần ăn đến hiệu quả chuyển hóa thức ăn(FCR) lợn con qua các tuần tuổi
a. Bố trí thí nghiệm:
Bố trí thí nghiệm như nội dung 3.3.2.
b. Chỉ tiêu nghiên cứu
- Hiệu quả chuyển hóa thức ăn (FCR (kgTA/kgTT): Hàng ngày cân
lượng thức ăn cho ăn, lượng thức ăn còn thừa để tính lượng thức ăn thu nhận. Tiêu tốn thức ăn/kg tăng khối lượng được tính theo công thức:
3.3.3. Ảnh hưởng của việc bổ sung sản phẩm Bacillus Weaner vào khẩu phần ăn đến tỷ lệ tiêu chảy và tỷ lệ chết của lợn con qua các giai đoạn phần ăn đến tỷ lệ tiêu chảy và tỷ lệ chết của lợn con qua các giai đoạn
a. Bố trí thí nghiệm
Bố trí thí nghiệm như nội dung 3.3.2.
- Ghi chép chính xác số lượng lợn con tiêu chảy, số ngày tiêu chảy và số lợn con chết. Từ đó xác định tỷ lệ tiêu chảy, tỷ lệ chết.
b. Chỉ tiêu nghiên cứu
Theo dõi, thống kê ghi chép đầy đủ chính xác số lượng lợn con chết của các ô chuồng trong thời gian thí nghiệm.
- Tỷ lệ chết:
Tỷ lệ chết (%) = Số con chết (con) x 100
Tổng số lợn trong đàn (con)
ADFI = Lượng thức ăn cho ăn (g) – Lượng thức ăn thừa (g) x 100 Số lợn thí nghiệm (con)
FCR (kg TA/kgTT) = Tổng lượng thức ăn thu nhận (kg)
- Tỷ lệ mắc tiêu chảy (%): theo dõi, thống kê ghi chép những lợn con bị tiêu chảy trong đàn và số ngày mắc tiêu chảy.
Tỷ lệ mắc tiêu chảy (%) = Tổng số ngày mắc tiêu chảy (ngày) x 100 Tổng số ngày nuôi (ngày)
3.3.4. Ảnh hưởng của việc bổ sung sản phẩm Bacillus Weaner vào khẩu phần ăn đến sức khỏe đường tiêu hóa lợn con phần ăn đến sức khỏe đường tiêu hóa lợn con
3.3.4.1. Ảnh hưởng của việc bổ sung sản phẩm Bacillus Weaner vào khẩu phần ăn đến thay đổi hệ vi sinh vật đường ruột lợn con
Những lợn con ở các lô tiến hành lấy mẫu ở các đoạn ruột không tràng, hồi tràng, manh tràng, kết tràng và trực tràng ở các giai đoạn 28, 56 ngày tuổi, mỗi lô tiến hành mổ lấy 6 mẫu từ 3 con đực và 3 con cái có kích thước, khối lượng trung bình so với toàn đàn để kiểm tra mật số các vi sinh vật. Các chỉ tiêu vi sinh vật đường ruột xác định gồm: tổng số Coliform, E.coli, Samonella,
Clostridium perfringens, Lactobacillus spp. theo các bước sau:
- Xác định Coliform theo tiêu chuẩn ISO 4832/2006
Cấy mẫu trên môi trường thạch thường: Đối với một mẫu kiểm nghiệm phải nuôi cấy ít nhất 3 đậm độ, mỗi đậm độ dùng 2 đĩa petri và 1 pipet vô khuẩn riêng. Lấy 1 ml sản phẩm (lỏng) hoặc dung dịch pha loãng ở những đậm độ khác nhau cho vào giữa từng đĩa petri. Rót vào từng đĩa 12 – 15 ml môi trường thạch, trộn đảo đều dung dịch mẫu và môi trường bằng cách lắc sang phải và sang trái mỗi chiều 3 lần. Để các đĩa thạch đông tự nhiên trên mặt ngang. Thời gian từ khi bắt đầu pha loãng mẫu đến khi rót môi trường không được quá 30 phút.
Nuôi cấy trong tủ ấm và đọc kết quả: Khi thạch đã đông, lật sấp các đĩa petri và để vào tủ ấm ở nhiệt độ 30 ± 10C từ 48 đến 72 giờ. Sau 48 giờ tính kết quả sơ bộ bằng cách đếm những khuẩn lạc đã mọc trên các đĩa nuôi cấy, sau 72 giờ tính kết quả chính thức. Chọn tất cả các đĩa có không quá 300 khuẩn lạc để tính kết quả.
- Xác định E.coli theo tiêu chuẩn TCVN7924-2:2008 (ISO 16649-2 : 2001) Cấy mẫu trên môi trường thạch TBX: Dùng micropipet vô trùng chuyển 1 ml mẫu thử pha loãng ban đầu (10-1) vào đĩa Petri vô trùng. Cấy vào 2 đĩa petri ở mỗi độ pha loãng. Lặp lại quy trình trên cho các dung dịch pha loãng thập phân tiếp theo, sử dụng một pipet mới vô trùng cho mỗi độ pha loãng.
Rót vào mỗi đĩa petri khoảng 15 ml môi trường TBX mà trước đó đã được làm nguội đến khoảng từ 44 oC đến 47 oC trên nồi cách thủy.
Trộn cẩn thận dịch cấy với môi trường và để yên cho hỗn hợp đông lại, để các đĩa petri trên mặt phẳng mát nằm ngang. Thời gian tính từ khi phân phối dịch cấy vào đĩa đến khi rót môi trường không được quá 15 phút.
Nuôi cấy tủ ấm và đọc kết quả: Lật ngược các đĩa và để vào tủ ấm để ở 44