Phần 3 Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu
3.3. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
3.3.3. Ảnh hưởng của việc bổ sung sản phẩm bacillus weaner vào khẩu phần
phần ăn đến tỷ lệ tiêu chảy và tỷ lệ chết của lợn con qua các giai đoạn
a. Bố trí thí nghiệm
Bố trí thí nghiệm như nội dung 3.3.2.
- Ghi chép chính xác số lượng lợn con tiêu chảy, số ngày tiêu chảy và số lợn con chết. Từ đó xác định tỷ lệ tiêu chảy, tỷ lệ chết.
b. Chỉ tiêu nghiên cứu
Theo dõi, thống kê ghi chép đầy đủ chính xác số lượng lợn con chết của các ô chuồng trong thời gian thí nghiệm.
- Tỷ lệ chết:
Tỷ lệ chết (%) = Số con chết (con) x 100
Tổng số lợn trong đàn (con)
ADFI = Lượng thức ăn cho ăn (g) – Lượng thức ăn thừa (g) x 100 Số lợn thí nghiệm (con)
FCR (kg TA/kgTT) = Tổng lượng thức ăn thu nhận (kg)
- Tỷ lệ mắc tiêu chảy (%): theo dõi, thống kê ghi chép những lợn con bị tiêu chảy trong đàn và số ngày mắc tiêu chảy.
Tỷ lệ mắc tiêu chảy (%) = Tổng số ngày mắc tiêu chảy (ngày) x 100 Tổng số ngày nuôi (ngày)
3.3.4. Ảnh hưởng của việc bổ sung sản phẩm Bacillus Weaner vào khẩu phần ăn đến sức khỏe đường tiêu hóa lợn con phần ăn đến sức khỏe đường tiêu hóa lợn con
3.3.4.1. Ảnh hưởng của việc bổ sung sản phẩm Bacillus Weaner vào khẩu phần ăn đến thay đổi hệ vi sinh vật đường ruột lợn con
Những lợn con ở các lô tiến hành lấy mẫu ở các đoạn ruột không tràng, hồi tràng, manh tràng, kết tràng và trực tràng ở các giai đoạn 28, 56 ngày tuổi, mỗi lô tiến hành mổ lấy 6 mẫu từ 3 con đực và 3 con cái có kích thước, khối lượng trung bình so với toàn đàn để kiểm tra mật số các vi sinh vật. Các chỉ tiêu vi sinh vật đường ruột xác định gồm: tổng số Coliform, E.coli, Samonella,
Clostridium perfringens, Lactobacillus spp. theo các bước sau:
- Xác định Coliform theo tiêu chuẩn ISO 4832/2006
Cấy mẫu trên môi trường thạch thường: Đối với một mẫu kiểm nghiệm phải nuôi cấy ít nhất 3 đậm độ, mỗi đậm độ dùng 2 đĩa petri và 1 pipet vô khuẩn riêng. Lấy 1 ml sản phẩm (lỏng) hoặc dung dịch pha loãng ở những đậm độ khác nhau cho vào giữa từng đĩa petri. Rót vào từng đĩa 12 – 15 ml môi trường thạch, trộn đảo đều dung dịch mẫu và môi trường bằng cách lắc sang phải và sang trái mỗi chiều 3 lần. Để các đĩa thạch đông tự nhiên trên mặt ngang. Thời gian từ khi bắt đầu pha loãng mẫu đến khi rót môi trường không được quá 30 phút.
Nuôi cấy trong tủ ấm và đọc kết quả: Khi thạch đã đông, lật sấp các đĩa petri và để vào tủ ấm ở nhiệt độ 30 ± 10C từ 48 đến 72 giờ. Sau 48 giờ tính kết quả sơ bộ bằng cách đếm những khuẩn lạc đã mọc trên các đĩa nuôi cấy, sau 72 giờ tính kết quả chính thức. Chọn tất cả các đĩa có không quá 300 khuẩn lạc để tính kết quả.
- Xác định E.coli theo tiêu chuẩn TCVN7924-2:2008 (ISO 16649-2 : 2001) Cấy mẫu trên môi trường thạch TBX: Dùng micropipet vô trùng chuyển 1 ml mẫu thử pha loãng ban đầu (10-1) vào đĩa Petri vô trùng. Cấy vào 2 đĩa petri ở mỗi độ pha loãng. Lặp lại quy trình trên cho các dung dịch pha loãng thập phân tiếp theo, sử dụng một pipet mới vô trùng cho mỗi độ pha loãng.
Rót vào mỗi đĩa petri khoảng 15 ml môi trường TBX mà trước đó đã được làm nguội đến khoảng từ 44 oC đến 47 oC trên nồi cách thủy.
Trộn cẩn thận dịch cấy với môi trường và để yên cho hỗn hợp đông lại, để các đĩa petri trên mặt phẳng mát nằm ngang. Thời gian tính từ khi phân phối dịch cấy vào đĩa đến khi rót môi trường không được quá 15 phút.
Nuôi cấy tủ ấm và đọc kết quả: Lật ngược các đĩa và để vào tủ ấm để ở 44
oC trong khoảng từ 18 giờ đến 24 giờ. Tổng thời gian ủ không được quá 24 giờ. Sau giai đoạn ủ ấm quy định, đếm các CFU điển hình của Escherichia coli dương tính β-glucuronidaza trên mỗi đĩa thạch chứa ít hơn 150 CFU điển hình và ít hơn 300 CFU tổng số (điển hình và không điển hình).
Vi khuẩn ở nhiệt độ 44 oC hình thành các khuẩn lạc màu xanh điển hình trên môi trường TBX, dương tính β-glucuronidaza (β-glucuronidase-positive
Escherichia coli).
- Xác định Salmonella theo tiêu chuẩn ISO 6579/2003
Cấy ria trên bề mặt nghiêng của thạch và cấy đâm sâu xuống đáy. Ủ ở 37 °C ± 1 °C trong 24 h ± 3 h.
Diễn giải những thay đổi trong môi trường như sau: + Cấy đâm sâu
Màu vàng: glucoza dương tính (sử dụng glucoza.
Màu đỏ hoặc không đổi màu: glucoza âm tính (không sử dụng glucoza..
Màu đen: sinh hydro sunfua.
Bọt hoặc vết rạn: sinh khí từ glucoza. + Bề mặt nghiêng của thạch
Màu vàng: lactoza dương tính.
Màu đỏ hoặc không đổi màu lactoza và sucroza âm tính (không sử dụng lactoza cũng như không sử dụng sucroza.
Các khuẩn lạc Salmonella điển hình thể hiện tính kiềm (màu đỏ) trên bề mặt nghiêng của thạch và khi cấy đâm sâu mang tính axit (màu vàng) có sinh khí (bọt khí) và (với khoảng 90 % trường hợp) sinh hydrosunfua (thạch bị đen) .
Khi Salmonella dương tính với lactoza được phân lập, thì trên bề mặt nghiêng của thạch TSI có màu vàng. Do vậy, việc khẳng định sơ bộ các chủng Salmonella không chỉ dựa trên các kết quả của phép thử trên thạch TSI
- Xác định Clostridium perfringen theo tiêu chuẩn TCVN 4991:2005 (ISO 7937/2004)
Cấy mẫu trên môi trường thạch SC: Dùng micropipette vô trùng cho vào mỗi đĩa 1 ml mẫu đã pha loãng cho vào chính giữa hai đĩa petri vô trùng. Rót vào mỗi đĩa 10 ml đến 15 ml thạch SC, được duy trì ở 44 °C đến 47 °C trong nồi cách thủy và trộn đều chất cấy bằng cách xoay nhẹ từng đĩa. Khi môi trường đã đông đặc lại thì phủ kín thêm một lớp dày 10 ml của cùng loại thạch SC.
Nuôi cấy tủ ấm và đọc kết quả: Để cho đông đặc lại. Đặt các đĩa vào các bình môi trường cải biến hoặc các vật đựng thích hợp khác và ủ trong các điều kiện kỵ khí ở 37 °C trong 20 ± 2 giờ.
Sau giai đoạn ủ qui định, chọn tất cả các đĩa chứa ít hơn 150 khuẩn lạc. Từ các đĩa này, chọn các đĩa đại diện cho các độ pha loãng liên tiếp, nếu có thể. Đếm các khuẩn lạc điển hình của C.perfringens trên mỗi đĩa.
Vi khuẩn C.perfringens trên môi trường thạch SC, hình thành các khuẩn lạc điển hình (kết tủa đen, do khử sunfit thành sunfua, làm cho màu khuẩn lạc bị đen).
- Xác định Lactobacillus spp theo tiêu chuẩn TCVN 8737:2011
Cấy mẫu trên môi trường thạch MRS: Đối với một mẫu kiểm nghiệm phải nuôi cấy ít nhất 3 đậm độ pha loãng, mỗi đậm độ dùng 2 đĩa petri vô trùng. Lấy 1 ml mẫu hoặc dung dịch pha loãng ở các đậm độ khác nhau cho vào giữa từng đĩa petri. Môi trường MRS thạch đã tan chảy, để nguội đến 45 0C ± 1 0C. Rót vào từng đĩa 12 ml đến 15 ml môi trường thạch, đảo đều dung dịch mẫu với môi trường bằng cách lắc 3 lần sang phải và 3 lần sang trái. Để các đĩa thạch đông tự nhiên trên mặt phẳng mát, nằm ngang. Thời gian bắt đầu pha loãng đến khi rót môi trường vào đĩa không được quá 30 phút.
Nuôi cấy tủ ấm và đọc kết quả: Khi thạch đã đông, lật úp đĩa và cho vào tủ ấm 5 % CO2, ở 37 0C trong thời gian từ 24 đến 72 giờ. Nếu không có tủ ấm CO2, có thể tạo điều kiện yếm khí để nuôi cấy bằng cách: sau khi các đĩa thạch đã đông, đổ thêm một lớp thạch lên trên để tạo điều kiện yếm khí. Sau 48 h, đọc kết quả sơ bộ. Sau 72 giờ, đọc kết quả, đếm tổng số các khuẩn lạc mọc trên các đĩa.
Vi khuẩn Lactobacillus trên môi trường thạch MRS làm chuyển màu đĩa môi trường từ đỏ tía sang màu vàng, khuẩn lạc có đường kính từ 1 mm đến 3 mm, màu vàng, hình thấu kính hoặc hình sao.
3.3.4.2. Ảnh hưởng của việc bổ sung sản phẩm Bacillus Weaner vào khẩu phần ăn đến thay đổi kích thước vi lông nhung đường ruột lợn con
- Đánh giá tác động đến thay đổi vi lông nhung đường ruột.
Mỗi lô thí nghiệm mổ 6 con trong đó 3 con đực và 3 con cái có kích thước khối lượng trung bình so với toàn đàn để lấy mẫu tá tràng, không tràng và hồi tràng. Cắt lấy mẫu niêm mạc ở tá tràng, không tràng và hồi tràng lợn, mỗi đoạn lấy khoảng 2-3 cm. Mẫu được bảo quản trong formalin 10%. Tiêu bản vi thể được làm theo quy trình chuẩn.
- Phương pháp làm tiêu bản vi thể Các bước làm tiêu bản vi thể:
Bước 1: cố định mẫu trong dung dịch formalin 10%
Bước 2: vùi mẫu và đưa mẫu vào hệ thống máy chuyển đúc mẫu tự động Leica Tissue Processing
Bước 3: đúc block trong parafin nóng chảy Leica Embedding Center Bước 4: cắt dán mảnh và cố định tiêu bản
Bước 5: nhuộm HE với thuốc nhuộm Hematoxylin và Eosin Bước 6: gắn lamen
- Đánh giá biến đổi hình thái biểu mô niêm mạc ruột:
Tiêu bản gắn trên lam kính được quan sát dưới kính hiển vi Kniss MBL- 2000T (Olympus, Japan) ở độ phóng đại 40 và 100 và 400 lần.
Kích thước lông nhung (chiều cao, chiều rộng) được đo bằng bằng phần mềm Infinity Analysis với máy ảnh Olympus gắn kính hiển vi.