2.5.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước thuộc lĩnh vực đề tài
Những kết quả nghiên cứu về Probiotics trên lợn đã được E.Doyle (2001) Viện nghiên cứu thực phẩm thuộc Trường Đại Học Wisconsin - Madison tập hợp như sau:
- Lactobacillus và Bifidobacteria giúp lợn con tăng trưởng và giảm tỷ lệ tử vong.
- Lactobacillus casei cải thiện tăng trưởng lợn con và giảm tiêu chảy có hiệu quả hơn so với kháng sinh liều thấp.
Kyriakis et al. (1999) nghiên cứu ảnh hưởng của Probiotics LSP- 122 đến việc phòng ngừa bệnh tiêu chảy ở heo con giai đoạn 28 ngày tuổi. Thí nghiệm được tiến hành trên 4 lô: lô 1 không dùng Probiotic, lô 2 sử dụng vi khuẩn
Bacillus toyoi với liều 106 bào tử/g TA, lô 3 và lô 4 sử dụng Bacillus licheniformis với liều 106 và 107 bào tử/g TA. Kết quả cho thấy các lô thí nghiệm (lô 2,3 và 4) đều có tỷ lệ tiêu chảy và tình trạng tiêu chảy ít nghiêm trọng hơn so với lô đối chứng (p< 0,05). Ngoài ra, tăng trọng/ngày, tiêu tốn thức ăn cũng cải thiện hơn so với lô đối chứng. Trong đó lô sử dụng 107 bào tử Bacillus lichenniformis kết quả tốt nhất.
Scheuemann (1993) bổ sung probiotic trong thức ăn của lợn con sẽ cải thiện được tỷ lệ tiêu hoá protein 5 - 6%.
Kyrikis et al. (1999) đã nghiên cứu ảnh hưởng của probitic LSP 122 đến phòng ngừa bệnh tiêu chảy ở lợn con giai đoạn 28 ngày tuổi. Thí nghiệm được tiến hành trên 4 lô: lô 1 không dùng probitic, lô 2 sử dụng vi khuẩn Bacillus toyoi với liều 106 bào tử/g TA, lô 3 và lô 4 sử dụng Bacillus licheniformis với liều 106 và 107 bào tử/g TA. Kết quả thí nghiệm cho thấy các thí nghiệm ở lô 2,3 và 4 đều có tỷ lệ tiêu chảy và tình trạng tiêu chảy ít nghiêm trọng hơn so với lô đối chứng (p<0,05). Ngoài ra tăng trọng/ngày, tiêu tốn thức ăn cũng cải thiện hơn lô đối chứng.
Hadani et al. (2002) sử dụng chế phẩm probactric (probiotic dạng lỏng, chứa vi khuẩn hoại sinh E.coli dòng ATCC 202226) cho lợn con với liều 3ml/con vào ngày thứ nhất và ngày thứ 3 sau khi sinh để phòng ngừa tiêu chảy. Kết quả cho thấy tỷ lệ tiêu chảy giảm 6,6%, tăng trọng/ ngày là 11g và tỷ lệ chết giảm 5,4% so với đối chứng.
2.5.2. Tình hình nghiên cứu trong nước thuộc lĩnh vực đề tài
Trong đường ruột của động vật, hệ vi sinh vật luôn luôn ổn định, đảm bảo trạng thái thăng bằng cho hoạt động của đường ruột. Khi hệ vi sinh vật cân bằng thì những vi sinh vật có lợi, phần lớn là vi khuẩn lactic, chiếm 90% sẽ hoạt động hữu ích cho đường ruột. Nếu sự cân bằng này bị phá vỡ thì vi khuẩn có hại cạnh tranh phát triển, gây rối loạn đường tiêu hoá đẫn tới tiêu chảy. Xuất phát từ cơ sở trên, nhiều nhà nghiên cứu đã tạo các dạng chế phẩm khác nhau của vi khuẩn
hữu ích để đưa vào đường ruột tạo sự cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột. Ở nước ta nhiều công trình nghiên cứu về vấn đề này đã được công bố.
Nguyễn Như Viên (1976); (Chu Đức Thắng, 1997) đã sản xuất thành công chế phẩm Bacillus subtilis bằng cách cấy vi khuẩn Bacillus subtilis vào môi trường đậu tương, nước cám gạo, thậm chí trong cả nước râu ngô. Theo tác giả, trong hàm lượng Bacillus subtilis có thể hạn chế được vi khuẩn gram âm và gram dương. Có thể dùng chế phẩm để điều trị viêm ruột, ỉa chảy ở lợn các lứa tuổi khác nhau.
Đậu Ngọc Hào và cs. (2000) tiến hành bổ sung chế phẩm Saccharomyces
cerevisiae cho lợn con sau cai sữa, kết quả cho thấy, sau 14 ngày thí nghiệm, lô
thí nghiệm tăng trọng so với lô đối chứng là 103%, sau 21 ngày là 102%, sau 35 ngày là 102%. Như vậy khi bổ sung 1% chế phẩm nấm men Saccharomyces
cerevisiae thì khối lượng trung bình của lợn con sau cai sữa ở lô thí nghiệm cao
hơn so với lô đối chứng. Ngoài việc giúp cho tăng trọng của lợn con thì việc sử dụng chế phẩm Saccharomyces cerevisiae còn giảm được phần nào lượng thức ăn tiêu tốn. Ở lô có bổ sung 1% chế phẩm vào thức ăn thì lượng thức ăn tiêu tốn cho một lợn trong 17 ngày ít hơn so với lô đối chứng 1,5 kg thức ăn và trong 25 ngày ít hơn 1,1 kg.
Vũ Văn Quang (1999) dùng chế phẩm vi sinh vật Lactobacillus
acidophilus bổ sung cho lợn con thì tỷ lệ nhiễm bệnh tiêu chảy giảm từ 58,33%
xuống còn 25%. Đồng thời chế phẩm vi sinh vật này có tác dụng làm cho vi khuẩn E.coli giảm đi như sau: Lô ĐC E.coli 68 ± 1,79 triệu vi khuẩn/1g phân
Salmonella 27,75 ± 0,81 triệu vi khuẩn/ 1g phân. Còn lô TN E.coli 61,18 ± 0,92
triệu vi khuẩn /1g phân, Salmonella 26,17 ± 1,81 triệu vi khuẩn/ 1g phân.
Phạm Khắc Hiếu và cs. (2002) nghiên cứu thức ăn vi sinh vật dạng kháng khuẩn của chế phẩm EM1 đã cho thấy chế phẩm EM1 có tác dụng ức chế với
E.coli, Samonella, Klebsiella, Shigella, Staphylococcus, Steptococcus,
Clostridium perfringen, Sarcina lutae. Kết quả điều tra số lượng vi khuẩn E.coli
trong 1g phân lợn sau khi dùng EM1 cho thấy giảm 7% ở lợn 1- 21 ngày tuổi, giảm 5,3% ở lợn 22- 60 ngày tuổi (phòng bệnh) và giảm 93% ở lợn 1- 21 ngày tuổi, giảm 53,6% ở lợn 22- 66 ngày tuổi (điều trị tiêu chảy).
Nguyễn Như Pho và Trần Thị Thu Thủy (2003) bước đầu thông báo các kết quả sử dụng chế phẩm Probiotics (Organic Green) trong phòng ngừa tiêu chảy trên
lợn con giai đoạn theo mẹ và giai đoạn sau cai sữa cho thấy tỷ lệ tiêu chảy giảm 1,5 - 3% trên lợn con theo mẹ và giảm 1,5 - 5,7% trên lợn con cai sữa; Tỷ lệ chết giảm 2 - 6% trên lợn con theo mẹ và trên lợn con cai sữa tỷ lệ chết là 0%.
Ngô Thị Hồng Thịnh (2008) sử dụng chế phẩm BIOSAF (probiotic). BIOSAF được sản xuất từ chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae. Trong khẩu phần lợn nái nuôi con và lợn con giống ngoại từ tập ăn đến cai sữa kết luận rằng:
+ Đối với lợn nái: việc bổ sung Biosaf trong thức ăn của lợn nái với 2 mức 0,1% và 0,16% không ảnh hưởng rõ rệt đến tỷ lệ hao mòn và thời gian động dục trở lại của lợn nái. Tuy nhiên lại có ảnh hưởng tích cực đến khả năng tiết sữa của lợn nái.
+ Đối với lợn con: ảnh hưởng tích cực đến khả năng thu nhận và chuyển hoá thức ăn. Tăng dần từ lô ĐC, TN1, TN2 là 10,4; 10,65; 10,80 g/con/ngày. Tăng khối lượng lợn con cai sữa/ổ. Lô ĐC là 45,23kg, tăng dần ở lô TN1 là 52,93kg và TN2 là 61,98kg. Giảm tỷ lệ tiêu chảy 22% ở TN2 so với ĐC, giảm chết với ĐC là 9,02%, ở TN2 so với ĐC là 12,73%.
Trần Quốc Việt (2006 - 2009) kết quả nghiên cứu hết năm 2008 đã phân lập được 64 chủng vi sinh vật từ các nguồn khác nhau, trong đó có 27 chủng vi khuẩn lactic và 39 chủng nấm men. Các chủng trên lại tiếp tục được sàng lọc, đánh giá các đặc điểm hình thái, trao đổi chất, phân loại sơ bộ và các lựa chọn được 4 chủng (hai chủng vi khuẩn lactic và hai chủng nấm men). Các chủng này đã được đánh giá là có các đặc tính probiotics, sau đó đã được định danh bằng phân tích trình tự 16S ARN. Kết quả phân loại và định dạnh cho thấy 2 chủng vi khuẩn lactic là: Lactobacillus fermantum và Lactobacillus casei. Hai chủng nấm men là Saccharomyces cerevisiae và Saccharomyces boulardi. Đã nghiên cứu tính tương thích của các chủng vi sinh vật probiotics. Các kết quả nghiên cứu cho thấy, tất cả các chủng vi sinh vật probiotics đều có tính chất tương thích cao và có thể tổ hợp theo nhiều cách khác nhau.
Đã tạo được môi trường lên men thích hợp để tạo chế phẩm probiotics dạng lỏng (môi trường MT0). Xác định được thời gian lên men thích hợp (48 giờ đối với vi khuẩn Bacillus và nấm men và 56 giờ đối với vi khuẩn Lactic). Chọn được chất mang thích hợp để sản xuất probiotics dạng bột theo phương pháp sấy phun và đưa ra được qui trình kỹ thuật sản xuất chế phẩm probiotics dạng lỏng và bột. Đã sản xuất được chế phẩm probiotics dạng lỏng (mật độ vi sinh vật hữu ích đạt 108-109 cfu/g) và dạng bột (mật độ vi sinh vật hữu ích đạt 107-108 cfu/g).
Những kết quả nghiên cứu trên lợn cho thấy, lợn ở các lô được ăn khẩu phần có bổ sung chế phẩm probiotics đa chủng (Bacillus subtilis (H4);
Saccharomyces boulardi - (SB.; Enterococcus faecium - 6H2; Lactobacillus
acidophilus - C3; Pediococcus pentosaceus - Đ7 và Lactobacillus fermentum - NC1) dạng bột có tốc độ sinh trưởng cao hơn so với lô đối chứng (không bổ sung kháng sinh và probiotics) 16,4%.
Trần Quốc Việt và cs. (2007) khi bổ sung chế phẩm Probiotic được sản xuất từ 2 chủng vi khuẩn lactic (Enterococcus faecium - 6H2; Lactobacillus acidophilus- C3) và một chủng Bacillus (Bacillus subtilis - H4) có hiệu quả rõ rệt với lợn con giai đoạn từ sau cai sữa 21 đến 60 ngày tuổi cả về khả năng tiêu hoá thức ăn (tỷ lệ tiêu hoá tăng từ 3,4- 6%) tốc độ sinh trưởng tăng (11,9%), hiệu quả chuyển hoá thức ăn (giảm tiêu tốn thức ăn 5,3%).
Nguyễn Quang Tuyên và cs. (2000) khi nghiên cứu sử dụng chế phẩm Probiotic - Lactobacillus acidophilus trong việc phòng và điều trị bệnh tiêu chảy ở lợn con từ 21 - 60 ngày tuổi tại trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên cho kết quả như sau: Lợn ở 45 ngày tuổi lô TN đạt 9,96 kg, lô ĐC chỉ đạt 9,49 kg. Sang đến giai đoạn 60 ngày tuổi lô TN đạt 17,19kg, lô ĐC chỉ đạt 14,89kg. Tỷ lệ lợn mắc bệnh tiêu chảy ở lô TN chỉ có 13,3% trong khi lô ĐC lên đến 41,1%.
PHẦN 3. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 3.1.1. Địa điểm nghiên cứu 3.1.1. Địa điểm nghiên cứu
- Trang trại chăn nuôi lợn Nguyễn Văn Thu. Địa chỉ: Xã Hoàng Lâu – Huyện Tam Dương – Tỉnh Vĩnh Phúc.
- Phòng thí nghiệm, Bộ môn Giải Phẩu – Tổ Chức, Khoa Thú Y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
- Phòng thí nghiệm, Bộ môn Ký sinh trùng, Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
3.1.2. Thời gian nghiên cứu
- Thời gian: thí nghiệm từ 01/12/2016 đến 15/07/2017. 3.2. ĐỐI TƯỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
3.2.1. Đối tượng nghiên cứu
- Lợn con theo mẹ từ 1 đến 28 ngày tuổi, số lượng 495 lợn con, giống 3 máu (Landrace x Yorshire - Duroc).
- Lợn con cai sữa 29 đến 56 ngày tuổi, số lượng 450 lợn con, giống 3 máu (Landrace x Yorshire - Duroc).
3.2.2. Vật liệu nghiên cứu
- Chế phẩm Bacillus Weaner do công ty BioSpring sản xuất.
Thành phần của sản phẩm: Tổng số bào từ Bacillus ≥1 x 1012CFU/kg
+ Bào tử Bacillus subtilis HU58……≥4 x 1011CFU/kg
+ Bào tử Bacillus coagulans………..≥3 x 1011CFU/kg
+ Bào tử Bacillus licheformis………≥3 x 1011CFU/kg. 3.3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.1. Kiểm tra tỷ lệ bảo toàn số lượng bào tử Bacillus sau quá trình ép viên thức ăn thức ăn
a. Bố trí thí nghiệm
Năm mẫu thức ăn cho lợn con sau ép viên được lấy tại nhà máy ngay sau khi sản xuất và gửi về phòng thí nghiệm trong 24 giờ. Các mẫu thức ăn được phân tích, kiểm tra số lượng bào tử Bacillus theo TCVN 8736:2011.
Các bước tiến hành phân tích mẫu kiểm tra số lượng vi khuẩn Bacillus
trong mẫu thức ăn có bổ sung chế phẩm PBW: Bước 1: Chuẩn bị dung dịch pha loảng mẫu
Cân 9 g NaCl, hòa tan trong nước cất đựng trong bình định mức 1000 ml, chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng là 7,0 ± 0,2 bằng dung dịch HCl 0,1 N và NaOH 0,1 N. Dùng ống đong cho vào bình nón mỗi bình 90 ml và dùng pipet lấy cho vào ống nghiệm mỗi ống 9 ml dung dịch trên. Đậy bằng nút bông không thấm nước, có giấy bạc, hấp tiệt trùng ở nhiệt độ 121 0C trong 15 phút. Bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 2 đến 8 0C, sử dụng trong 15 ngày.
Bước 2: Chuẩn bị môi trường nuôi cấy
Cân các thành phần môi trường PCA (Pepton 5,0 g, cao nấm men 2,5 g, D(+)-Glucose 1,0 g, Thạch 14,0 g, Nước cất 1000 ml), chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng là 7,0 ± 0,2 bằng dung dịch HCl 0,1 N và NaOH 0,1 N. Lắc đều và ñun cách thủy hoặc trong lò vi sóng đến khi sôi (môi trường trong). Rót vào bình 250 ml lượng môi trường 100 ml. Tiệt khuẩn trong nồi hấp ở nhiệt độ 121
0C trong 15 phút. Nếu môi trường sử dụng ngay, để nguội ñến 45 0C ± 1 0C ở bể điều nhiệt, nếu chưa sử dụng ngay thì cần bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ từ 2 ñến 8 0C không quá 30 ngày.
Bước 3: Chuẩn bị mẫu phân tích và pha loãng mẫu
Cân vô trùng khoảng 10 g (10 ml), chính xác đến 0,1 mg, mẫu thử cho vào bình nón đựng 90 ml dung dịch pha loãng đã tiệt trùng được độ pha loãng 10-1. Cho lên máy lắc đồng hoá mẫu khoảng 30 phút. Đặt trong bể điều nhiệt 80 0C trong 10 phút.
Dùng micropipet lấy 1 ml dịch pha loãng 10-1 từ bình nón mẫu đã đồng hóa cho vào ống nghiệm chứa 9ml dung dịch pha loãng đã tiệt trùng được độ pha loãng 10-2. Tiếp tục pha loãng tương tự đến độ pha loãng 10-5, 10-6, 10-7, 10-8 để đếm được từ 15 khuẩn lạc đến 300 khuẩn lạc trên đĩa thạch.
Hình 3.1. Pha loàng mẫu từ 10-1 đến 10-5 Bước 4: Cấy mẫu trên môi trường thạch PCA
Đối với một mẫu kiểm nghiệm phải nuôi cấy ít nhất 3 đậm độ pha loãng liên tiếp, mỗi đậm độ dùng 2 đĩa petri vô trùng. Lấy 1 ml mẫu hoặc dung dịch pha loãng ở các đậm độ khác nhau cho vào giữa từng đĩa petri. Môi trường PCA đã đun nóng chảy, để nguội đến 45 0C ± 1 0C. Rót vào từng đĩa 12 ml đến 15 ml môi trường thạch, đảo đều dung dịch mẫu với môi trường bằng cách lắc 3 lần sang phải và 3 lần sang trái. Để các đĩa thạch đông tự nhiên trên mặt phẳng mát, nằm ngang. Thời gian bắt đầu pha loãng đến khi rót môi trường vào đĩa không được quá 30 phút.
Bước 5: Nuôi cấy tủ ấm và đọc kết quả
Khi thạch đã đông, lật úp đĩa và cho vào tủ ấm 37 0C trong thời gian từ 18 giờ đến 24 giờ. Sau 24 giờ, đếm kết quả, đếm tổng số các khuẩn lạc mọc trên các đĩa thạch. Vi khuẩn Bacillus trên môi trường thạch PCA tạo thành khuẩn lạc màu trắng, hình dạng thay đổi. Chọn những đĩa có từ 15 khuẩn lạc đến 300 khuẩn lạc của 2 đậm độ pha loãng liên tiếp để tính kết quả. Nếu chênh lệch các giá trị ở 2 đậm độ nhỏ hơn hoặc bằng 2 lần.
b. Các chỉ tiêu nghiên cứu
- Tính số N bào tử cho 1 g hoặc 1 ml sản phẩm bằng cách tính trung bình cộng của tống số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa theo công thức sau:
Trong đó:
ΣC là tổng các khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa ñược giữ lại từ 2 đậm độ pha loãng tiếp theo;
V là thể tích mẫu cấy trên mỗi nĩa, tính bằng mililit (ml); n1 là số đĩa có đậm độ pha loãng thứ nhất được giữ lại; n2 là số đĩa có đậm độ pha loãng thứ hai được giữ lại; d là hệ số pha loãng tương ứng với độ pha loãng thứ nhất.
3.3.2 Ảnh hưởng của việc bổ sung sản phẩm Bacillus Weaner vào khẩu phần ăn đến một số chỉ tiêu năng suất lợn con qua các tuần tuổi
3.3.2.1. Ảnh hưởng của việc bổ sung sản phẩm Bacillus Weaner vào khẩu phần ăn đến khối lượng cơ thể lợn con qua các tuần tuổi
a. Bố trí thí nghiệm:
Dùng phương pháp phân lô so sánh: 495 lợn con giống ngoại 3 máu (Landrace – Yorshire x Duroc) của 16 ổ đẻ từ 16 nái có cùng lứa đẻ đang theo mẹ được phân làm 2 lô lặp lại 3 lần (mỗi lô 8 ổ đẻ) theo phương pháp khối ngẫu nhiên, hoàn toàn đảm bảo sự đồng đều về tuổi, khối lượng và chế độ chăm sóc quản lý.
- Lô ĐC: Tổng số lợn con được đưa vào thử nghiệm lần 1, lần 2, lần 3 lần lượt là 83, 80, 84 con được cho ăn tự do thức ăn dành cho lợn con đang sử dụng tại trại.
- Lô TN: Số lợn con thử nghiệm lần 1, lần 2, lần 3 lần lượt là 84, 81, 83.