Ghi chú: Các tế bào ST được nuôi cấy vào các đĩa 6 cm, gây nhiễm TGEV và bệnh tích tế bào (CPE) được chụp ảnh tại các thời điểm 24h (A), 40h (B), 48h (C) và 64h (D) giờ sau khi gây nhiễm. Hình ảnh của các tế bào không bị gây nhiễm (đối chứng âm) được hiển thị so sánh tại từng thời điểm (E, F, G, H)
Kết quả sau khi gây nhiễm TGEV vào các tế bào ST cho thấy CPE điển hình, bao gồm các tế bào tròn, to, thoái hóa hạt của tế bào chất, tách tế bào và tế bào bị phá hủy nhiều từ 40h đến 64h sau tiêm chủng (Hình 2.4 A-D) so với đối chứng không nhiễm bệnh các tế bào (Hình 2.4 E-H).
Một nghiên cứu khác ở Trung Quốc đã sử dụng chủng CQ gây nhiễm trên tế bào ST. Kết quả cho thấy bệnh tích tế bào (CPE) đã được quan sát trong tế bào ST bị nhiễm virus. So sánh với các tế bào đối chứng, các tế bào bị gây nhiễm có sự thay đổi tế bào chất cho thấy các tế bào tròn, bóng, tế bào tập trung lại tạo
thành cụm và sau 48 giờ gây nhiễm 95% tế bào bong tróc(Zhenhui et al., 2015).
Nghiên cứu của(An et al., 2014) đã tiến hành gây nhiễm TGEV trên tế bào
PK - 15. Tế bào PK-15 được nuôi cấy trên các đĩa nuôi cấy tế bào được gây nhiễm bằng chủng TGEV WH-1 với hệ số gây nhiễm (MOI) 0,1, kiểm tra bệnh tích tế bào (CPE) sau 0, 6, 12, 24, 36h sau gây nhiễm. Kết quả cho thấy bệnh tích tế bào đươc thấy sau 12h gây nhiễm và sau 36h gây nhiễm các tế bào chết nhanh chóng và CPE được quan sát rõ nhất. Hiệu giá virus đạt cao nhất ở 36h sau khi gây nhiễm sau đó giảm dần.
Hình 2.5. Đƣờng cong sinh trƣởng của TGEV trên tế bào PK - 15
Nguồn: An et al. (2014) Nghiên cứu sự tiến triển bệnh tích tế bào (CPE) trong môi trường nuôi cấy SK. Các tế bào SK đã được chuẩn bị từ thận của lợn 3 đến 4 tuần tuổi.Cấy chuyển liên tục chủng TGE 185 và 198 trong các tế bào SK, cả hai chủng cho
thấy CPE đã phát triển bắt đầu xuất hiện ở lần đời thứ 4 và mức độ bệnh tích tế bào tăng lên ở đời thứ 5, 6 và 7. Bệnh tích tế bào quan sát được trong 48h đến 72h sau khi gây nhiễm là các cụm và chuỗi các tế bào hình tròn lớn dường như nằm trên đỉnh của tấm tế bào. Kết quảnhuộm bằng kháng thể huỳnh quang cho thấy 6h sau khi bị gây nhiễm đã phát hiện được các tế bào nhiễm virus. Cường độ huỳnh quang và số lượng tế bào huỳnh quang tăng lên đến 24h sau gây nhiễm.
Độ pH của môi trường nuôi cấy tế bào có ảnh hưởng rõ rệt đến sự phát triển và sự ổn định của virus viêm dạ dày ruột truyền qua (TGEV) trong nuôi cấy tế bào tuyến giáp lợn (APT/2). Ở pH 6,5, virus nhân lên cao gấp 10 lần so với nuôi cấy ở pH 7,2 và cao hơn 100 lần so với pH 8,0. Các bước hấp phụ, xâm nhập và sao chép virus đã được chứng minh là không bị ảnh hưởng bởi sự thay đổi pH. Trong 12h đầu tiên sau khi gây nhiễm, pH 6,5-8,0 không ảnh hưởng đến sự tổng hợp ARN. Tuy nhiên sau 12h, sự phân hủy ARN xảy ra trong môi trường nuôi cấy ở pH 7,2 và 8,0 nhưng không xảy ra pH 6,5.
2.2.2.3. Sức đề kháng của virus
TGEV rất bền khi bảo quản đông lạnh nhưng dễ bị phá hủy ở nhiệt độ
phòng hoặc cao hơn.Trong thời gian bảo quản 6-18 tháng ở nhiệt độ -200C, hiệu
giá virus ở ruột lợn không hề thay đổi. Ở nhiệt độ 370C, cứ sau 24h hiệu giá của
virus giảm đi 1log10. Trong môi trường nuôi cấy tế bào khi giữ ở nhiệt độ -200C,
-400C hoặc -80oC hiệu giá và tính gây bệnh của virus không thay đổi sau 365
ngày, nhưng khi giữ ở 37oC virus mất tính gây bệnh sau 4 ngày. Trong phân, chất
độn chuồng virus tồn tại được 8 tuần ở 50C, 2 tuần ở 200C và 24 giờ ở 350 C. TGEV rất mẫn cảm với ánh sáng, chúng bị bất hoạt sau 6h dưới ánh sáng mặt trời. Với các chất hóa học thông thường, virus tương đối bền: bị bất hoạt với formalin 0,03%, lysovet 1% (gồm phenol và aldehyde), beta propiolactone
0,01%, NaCl, NaOH 1mM, iodine, hợp chất chứa NH4+
, ether, chloroform. Một số chủng TGEV gây bệnh có khả năng kháng lại trypsine, tương đối bền trong mật lợn, chịu được pH = 3. Các đặc tính này giúp virus tồn tại trong dạ dày và ruột non của lợn. Tuy nhiên các đặc tính này thay đổi tùy chủng virus và người ta cũng chứng minh được mối liên hệ giữa đặc tính sinh học này của virus với độc lực của chúng.
2.2.2.4. Bệnh tích của lợn sau khi gây nhiễm TGEV
Năm 2019,(Wang et al., 2019) đã tạo ra một virus tái tổ hợp TGEV-GFP,
tiếp tục gây đột biến bằng cách xóa 224 axit amin ở N-terminal để tạo ra TGEV-GFP-AS_NTD. Tiến hành gây nhiễm lợn con, kết quả cho thấy TGEV- GFP-AS_NTD gây ra tỷ lệ tử vong 40% ở lợn con và tổn thương mô ruột rõ ràng, trong nhóm TGEV-GFP lợn biểu hiện các triệu chứng lâm sàng nghiêm trọng tỷ lệ tử vong cao (lên tới 100%) và xuất hiện các triệu chứng sớm hơn so với lợn trong nhóm TGEV-GFP-AS_NTD. Ở nhóm gây nhiễm thành ruột mỏng, trong suôt hơnso với lợn ở nhóm đối chứng không gây nhiễm (Hình 2.6).
Hình 2.6. Bệnh tích đại thể của lợn đƣợc gây nhiễm virus tái tổ hợp
Nguồn: (Wang et al., 2019)
2.2.3. Virus gây bệnh tiêu chảy cấp ở lợn
2.2.3.1. Cấu trúc phân tử của PEDV
PEDV là virus có vỏ ngoài bao bọc, đường kính biến đổi từ 90 đến 190 nm. Virus có mộtnhân đậm đặc điện tử với quầng sáng ở giữa và những phần tỏa ra từ nhân dạng chùy dài xấp xỉ 20nm. Virus nhân lên thông qua việc nẩy chồi từ các màng bên trong bào tương tế bào vật chủ. Bộ gen của virus PED là RNA dạng sợi đơn dương kích thước khoảng 28kb với mũ 5’ và đuôi là polyA 3’. Bộ gen của virus gồm một vùng không dịch mã đầu (UTR) 5’, một UTR đầu 3’, có ít nhất 7 khung đọc mở (ORF) mã hóa cho 4 protein cấu trúc gồm gai (S), vỏ (E), màng (M), và nucleocapsid (N) và 3 protein không cấu trúc (enzyme tái bản replicase 1a, 1b và ORF3). Những khung đọc mở này được sắp xếp theo trình tự: 5’-replicase (1a, 1b)-S-ORF3-E-M-N-3’. Protein cấu trúc của PEDV tương tự
như các coronavirus khác. Virus có một protein gai (S) với trọng lượng phân tử khoảng 180-200 kDa, một protein màng (M) 27-32 kDa, một protein nucleocapsid gắn với RNA nặng 57-58 kDa. Hai khung đọc mở ORF (Open Reading Frame - ORF) 1a và 1b, chiếm 2/3 bộ gen tính từ đầu 5’ mã hoá cho các protein phi cấu trúc (replicase 1a và 1b). ORF1 là sản phẩm của việc sao chép polyprotein 1a trong khi ORF1b được biểu thị bằng sự dịch chuyển khung ribosome −1 (RFS). Gen ORF3 là một gen phụ trợ, nằm giữa các gen cấu trúc, nó mã hóa cho 1 protein bổ trợ, các coronavirus khác nhau có số lượng và trình tự gen khác nhau.
Hình 2.7.Cấu trúc bộ gen của PEDV
Ghi chú: Sơ đồ của tổ chức bộ gen PEDV và các miền suy ra của protein S, bao gồm một đoạn peptide tín hiệu (SP); Vùng S1, bao gồm S1-NTD (21 - 32) và S1-CTD (253-638); Vùng S2; miền xuyên màng
(TM); và đuôi tế bào chất (Cyto)
Nguồn: Deng et al. (2016). Protein S của PEDV là một loại gai glycoprotein (kháng nguyên bề mặt) trên bề mặt virus, đóng vai trò quan trọng trong việc điều hoà tương tác với các glycoprotein thụ thể đặc hiệu trên tế bào vật chủ trong quá trình xâm nhập, kích thích tạo kháng thể trung hoà ở vật chủ tự nhiên(Chang et al., 2002). Protein S có kích thước 1.383 amino acids, bao gồm một gồm một đoạn peptide tín hiệu (1- 20aa); một vùng S1 (21 - 793 aa) có tác dụng gắn kết các hạt virus vớicác thụ thể bề mặt tế bào; một vùng S2 (794 - 1385 aa) làm trung gian phản ứng tổng hợp virus với các tế bào chủ; một miền xuyên màng (1335 - 1358) và đuôi tế bào chất (1359 - 1385); Khu vực S1 chứa hai miền phụ là S1-NTD (21 - 324aa) và S1- CTD (253 - 638 aa).Vùng S1 của các coronavirus chứa miền liên kết với thụ thể, có vai trò trong quá trình tương tác với các thụ thể tế bào để gắn virus. Miền đầu cuối N của miền S1 cần thiết trong quá trình liên kết thụ thể. Protein S liên quan tới sự thích nghi sinh trưởng trong điều kiện phòng thí nghiệm và sự giảm độc
lực khi gây bệnh trên động vật, ngoài ra gen S còn được sử dụng để đánh giá mối quan hệ di truyền cũng như sự tiến hóa của các chủng virus PED đang lưu hành. Các biến thể di truyền của coronavirus tập trung ở phần S1 của gen S. Đột biến, xóa và / hoặc chèn trong protein S có thể thay đổi khả năng gây bệnh và tính kháng nguyên. Chính vì vậy, trong nghiên cứu chế tạo vacxin phòng bệnh, hiện tại các nhà khoa học chủ yếu tập trung vào glycoprotein này. (Sun et al.,
2015)báo cáo rằng một chủng CHN / FL2013 với việc loại bỏ 7 aa của protein S làm giảm độc lực của virus trong nuôi cấy tế bào. Một nghiên cứu khác về chủng MF3809 / 2008 của Hàn Quốcđã chỉ ra rằng bằng việc xóa 204 aa tại các vị trí axit amin 713 - 916 của protein S làm giảm độc lực virus và thay đổi hướng mô từ ruột. Trong những năm gần đây, các chủng đột biến S mới đã liên tục được tìm thấy và điều này có thể liên quan đến áp lực miễn dịch của các loại vacxin được sử dụng, bao gồm cả các chủng từ các chủng vacxin CV777 và DR13.
Gen ORF3 nằm giữa gen S và E trong bộ gen PEDV, là gen mã hoá cho protein không cấu trúc và là protein phụ trợ, gen này không cần thiết cho quá trình nhân lên của PEDV.Tuy nhiên nghiên cứu của(Ye et al., 2015) cho thấy, PEDV trong quá trình cấy chuyển nhiều lần trên tế bào dẫn đến 1 nucleotite 49 hoặc 51 ở vùng gen ORF3 bị xóa có liên quan đến đọc lực của virus. Nghiên cứu còn chứng minh rằng gen ORF3 của PEDV có thể kéo dài pha S tạo điều kiện cho sự hình thành tiểu bào và do đó thúc đẩy sự tăng sinh của PEDV. Sự khác biệt của gen ORF3 cũng được thấy rõ giữa các chủng thực địa và các chủng nuôi cấy trong phòng thí nghiệm(Park et al., 2008; Wongthida et al., 2017).
Protein M nằm trên bề mặt của virus, là thành phần vỏ lớn nhất của virus PED, glycoprotein cấu trúc màng với một đầu tận cùng gắn amin ngắn phía ngoài virus và một đầu tận cùng gắn carboxy ở bên trong (Bernasconi et al., 1995). Protein M đóng vai trò quan trọng trong quá trình lắp ráp virus(Nguyen & Hogue, 1997)ngoài ra protein M còn tạo ra kháng thể trung hoà virus với sự có mặt của bổ thể(Saif, 1993). Protein M kích thích quá trình tạo ra α-
interferon(Laude et al., 1992). Việc đồng thời biểu hiện protein M và N cho phép
tạo thành các hạt giả virus có khả năng biểu lộ hoạt tính sinh interferon tương tự như hạt virus hoàn chỉnh. Nghiên cứu về glycoprotein M sẽ làm tăng thêm hiểu biết về mối quan hệ di truyền, sự đa dạng giữa các chủng PEDV và tình trạng dịch tễ của PEDV trên thực địa(Wang et al., 2010).
Protein N của coronavirus tương tác với genARN virus và liên kết với các phân tử protein N khác để bảo vệ bộ gen của virus, là kháng nguyên chiếm ưu thế được sản xuất trong các tế bào bị nhiễm coronavirus. Protein N có vai trò quan trọng đối với phản ứng miễn dịch qua trung gian tế bào, làm kéo dài giai đoạn S của chu kỳ tế bào nó còn là nguyên nhân gây stress lưới nội chất đồng thời làm tăng NF-kB, Bcl-2 và interleukin 8 (Xu et al., 2013b). Ngoài ra protein này rất hữu ích cho việc chẩn đoán sớm và chính xác nhiễm trùng do PEDV.
Các nghiên cứu trước đây cho thấy protein E cùng với protein M đóng vai trò quan trọng trong quá trình lắp ráp virus. Nó đóng vai trò của một kênh ion ảnh hưởng đến việc phát tán virus, đa số protein E nằm trong lưới nội chất, với số lượng nhỏ được nằm trong nhân. Protein E không ảnh hưởng đến sự phát triển của tế bào biểu mô ruột (IEC) và chu kỳ tế bào nhưng nó góp phần gây stress lưới nội chất đồng thời làm tăng interleukin 8 (Xu et al., 2013a).
2.2.3.2. Đặc tính nuôi cấy
Việc nuôi cấy virus trong điều kiện phòng thí nghiệm thời gian đầu gặp rất nhiều khó khăn mặc dù đã thử nghiệm nuôi cấy trên nhiều loại tế bào nhưng tỉ lệ thành công là rất thấp. Việc phân lập virus có ý nghĩa rất quan trọng trong việc chẩn đoán bệnh, dịch tễ học, và công tác quản lý dịch bệnh.
Khả năng thích ứng của virus PED với tế bào ruột non trong điều kiện của phòng thí nghiệm rất kém. Quá trình sinh trưởng của virus PED trên môi trường nuôi cấy tế bào hết sức khó khăn. Với các tế bào không được xử lý với trypsin hoặc dịch tụy thì không thích hợp để virus nhân lên và virus có thể dần mất khả
năng gây nhiễm khi cấy truyền ở các đời xa hơn(Callebaut et al., 1982). Hiện nay
tế bào Vero là dòng tế bào thích hợp nhất để phân lập và nhân giống virus PED trong phòng thí nghiệm (một dòng tế bào tách từ tế bào thận khỉ xanh châu Phi). Ngoài ra, PEDV đã được nhân lên thành công trên các tế bào thận lợn và bàng
quang lợn ở Nhật Bản(Shibata et al., 2000). Chủng virus phân lập tại Nhật Bản
(P-5V) đã được sử dụng làm chủng virus vacxin và được nuôi cấy trên các dòng tế bào lợn KSEK6 và IB -R.
Một vacxin khác dùng cho lợn con bú mẹ có thể chế từ virus giảm độc lực thu được qua việc cấy chuyển nhiều đời (93 đời cấy chuyển) của virus PED trên môi trường nuôi cấy tế bào Vero (Kweon et al., 1993). Ở Nhật Bản, một loại
tế bào nuôi cấy đã được sử dụng phòng bệnh cho nái từ năm 1997. Mặc dù những vacxin này được xem là khá hiệu quả, tuy nhiên không phải tất cả lợn nái sử dụng vacxin đều tạo được miễn dịch qua sữa ổn định.
Nghiên cứu cấy chuyển PEDV trong môi trường tế bào Vero, (Hofmann
and Wyler, 1988); (Kusanagi et al., 1992)đã tiến hành cấy chuyển 3 đời liên tiếp
PEDV trong môi trường tế bào Vero có bổ sung 10 µg/ml trypsin(Chen et al., 2014, Kweon et al., 1993) đã tiến hành cấy chuyển 4 đời liên tiếp trong môi trường tế bào Vero có bổ sung 5 µg/ml trypsin (Chang et al., 2002) cấy chuyển 5 đời liên tiếp trong môi trường không bổ sung trypsin(Pan et al., 2012) cấy chuyển 7 đời liên tiếp trong môi trường có bổ sung 10 µg/ml trypsin. Quan sát sự thích ứng nhân lên của PEDV qua các đời cấy chuyển(Hofmann and Wyler, 1988)đã thấy rằng: Đời phân lập đầu tiên CPE xuất hiện sau 3-5 ngày gây nhiễm và tế bào bị phá hủy hoàn toàn sau 2 ngày kể từ khi xuất hiện bệnh tích tế bào và sau 4 đời cấy chuyển liên tiếp thì tế bào bị phá hủy hoàn toàn sau 96 giờ (4 ngày), bệnh tích tế bào (CPE) (đặc trưng bởi các đám tế bào bị dung giải màng, nhân tế bào co cụm lại với nhau hình thành các thể hợp bào). Hiệu giá virus đạt tối đa sau khi nuôi cấy 15 giờ. Năm 2018, (Nguyễn Thị Hoa và cs., 2018) đã tiến hành nuôi cấy, phân lập PEDV trên tế bào Vero và quan sát CPE của chúng, Kết quả, ở đời phân lập đầu tiên CPE thường được quan sát thấy trong vòng 12 - 24 giờ và tế bào bị phá hủy hoàn toàn sau 48 giờ gây nhiễm. Trong khi đó đời cấy chuyển P4 bệnh tích tế bào xuất hiện sớm hơn 8 - 12 giờ sau gâynhiễm và tế bào bị phá hủy hoàn toàn sau 36 giờ gây nhiễm (Hình 2.8).
Hình 2.8. Bệnh tích tế bào do PEDV gây ra trên ra trên tế bào Vero
Ghi chú: CPE sau 24 giờ gây nhiễm PEDV (E), CPE sau 36 giờ gây nhiễm PEDV (F)
Năm 2011,(Sato et al., 2011) đã nghiên cứu cấy chuyển chủng PEDV 83P-5 trong các tế bào Vero dẫn đến sự thích nghi tăng trưởng của virus trong các tế bào Vero ở đời thứ 22, tiếp tục cấy chuyển cho đến đời thứ 100 và phân tích các thay đổi về đột biến gen (S), màng (M) và nucleocapsid (N) và khả năng gây bệnh của virus ở đời 34, thứ 61 và 100. Kết quả phân tích trình tự cho thấy đột biến xảy ra ở đời 34 và 61 đã được chuyển sang đời thứ 100. Ngược lại, các gen M và N của virus cho thấy sự bảo tồn mạnh mẽ trong quá trình truyền nối tiếp.
Nghiên cứu tác dụng ức chế của gen phụ trợ ORF3 đối với sự sao chép PEDV trong ống nghiệm cho thấy ORF3 có vai trò quan trọng trong quá trình ức chế sự phiên mã của PEDV trong quá trình nuôi cấy tế bào. Sự vắng mặt hoặc