Lần tiếp đời
Vị trí nucleotide/ amino acid
79-80-81/ /27 232-233-234/ /78 583-584-585/ /195
P37 TCA S ATC I TAC Y
P100 TCA S GTC V TGC C
P120 TCA S GTC V TGC C
P130 TCA S GTC V TGC C
P140 GCA A GTC V TGC C
P150 GCA A GTC V TGC C
Đã có sự biến đổi trình tự nucleotide và amino acid được mã hóa ở gen S trong quá trình nhược độc hóa PEDV: vị trí amino acid 78 và 195. Hai thay đổi này là bảo thủ giữa các chủng PEDV nhược độc. Khi tiếp tục tiếp đời (đời P140 đến P150), xuất hiện đột biến nucleotide ở vị trí codon thứ 1 của bộ ba mã hóa, dẫn tới thay đổi từ Serine (S) sang Alanine (A) ở vị trí amino acid 27. Tuy nhiên, trình tự tiểu phần S1 hoàn toàn bảo thủ (không trình bày). Từ các kết quả trình bày ở bảng 4.3 đến bảng 4.5 cho thấy: chủng giống PEDV ổn định di truyền trong vòng 30 lần tiếp đời kể từ đời P100. Giống sẽ bị biến đổi nếu tiếp tục truyền đời.
4.3.2. Đặc điểm ổn định di truyền của chủng TGEV
Cây phát sinh chủng loại của chủng giống TGEV được trình bày ở hình 4.10.Kết quả phân loại ở hình 4.10 cho biết chủng giống AVAC/VR/TGE.15 thuộc nhóm cổ điển và không nằm cùng phân nhánh với các chủng virus TGEV nhược độc trên thế giới, ví dụ như Miller M60, Purdue P115 (mũi tên rỗng, hình 4.10). Chủng AVAC/VR/TGE.15 cũng nằm xa với virus thuộc nhóm PRCV.
Đặc điểm ổn định di truyền gen S của chủng giống TGEV dùng cho sản xuất vacxin (đời 130, P130) được làm rõ trên cơ sở so sánh mức tương đồng trình tự nucleotide và amino acid với các chủng ở lần tiếp đời thấp hơn (P5, P100, P120) và đời cao hơn (P140, P150).
Hình 4. 10. Cây phát sinh chủng loại của TGEV dựa vào trình tự gen S
Ghi chú: chủng giống TGEV vacxin (lần tiếp đời 130) được chỉ bằng mũi tên đầy màu đen. Các chủng virus tiếp đời xung quanh đời 130 được đánh dấu màu xanh nhạt.
Bảng 4.6. Mức độ tƣơng đồng nucleotide gen S của TGEV Lần tiếp đời P5 P100 P120 P130 P140 P100 0,997 P120 0,997 0,999 P130 0,997 0,999 1 P140 0,997 0,999 1 1 P150 0,997 0,999 1 1 1
Kết quả phân tích cho biết trình tự nucleotide gen S của TGEV nhược độc (đời 120 trở đi) có sai khác so với chủng TGEV còn độc lực (P5), với mức tương đồng 0,997. Các chủng TGEV từ lần tiếp đời 130 đến 150 giống nhau hoàn toàn về trình tự nucleotide của gen S (mức tương đồng là 1). Từ đời 100, đã xuất hiện đột biến nucleotide dẫn tới mức tương đồng so chủng giống (đời 130) chỉ còn 0,999 (vùng đóng khung, bảng 4.6). Chúng tôi tiếp tục phân tích trình tự amino acid suy diễn để làm rõ hơn bản chất của sự thay đổi nucleotide giữa các đời (bảng 4.7).
Bảng 4.7. Mức độ tƣơng đồng amino acid protein S của TGEV
Lần tiếp đời P5 P100 P120 P130 P140 P100 0,995 P120 0,994 0,999 P130 0,994 0,999 1 P140 0,994 0,999 1 1 P150 0,994 0,999 1 1 1
Mức tương đồng trình tự amino acid ở lần tiếp đời P100 so với các lần tiếp đời sau P120-P150 giống với mức tương đồng dựa vào trình tự nucleotide (bảng 4.6), chứng tỏ đột biến nucleotide là đột biến câm (silent mutation). Đáng lưu ý,
cácn lần tiếp đời từ P120 đến P150, không thấy đột biến nucleotide cũng như amino acid của TGEV. Kết quả phân tích trên toàn chiều dài gen S đã xác định được 8 vị trí đột biến và được trình bày ở bảng 4.8.
Bảng 4.8. Sự thay đổi trình tự nucleotide và amino acid của TGEV
Vị trí nu/ aa Lần tiếp đời P5 P100 P120 P130 P140 P150 64-66/ TTT > TCT TCT TCT TCT TCT /22 F > S S S S S 289-291/ TGG > TCG TCG TCG TCG TCG /97 W > S S S S S
622-624/ TTT TTT > ATT ATT ATT ATT
/208 F F > I I I I
1267-1269/ ACT > AGT AGT AGT AGT AGT
/423 T > S S S S S
1303-1305/ TTA > TTC TTC TTC TTC TTC
/435 L > F F F F F
1321-1323/ ATG > ATT ATT ATT ATT ATT
/441 M > I I I I I
1366-1368/ GTC > TTC TTC TTC TTC TTC
/446 V > F F F F F
1504-1506/ TGT > TTT TTT TTT TTT TTT
/502 C > F F F F F
Ghi chú: dấu “>“ biểu thị sự biến đổi nucleotide và amino acid ở 1 vị trí giữa các lần tiếp đời
Khác với chủng giống PEDV, từ chủng giống đời P130, nếu tiếp tục tiếp đời đến đời P150 không dẫn tới đột biến làm thay đổi trình tự amino acid được mã hóa. Nói cách khác, chủng giống TGEV ổn định di truyền trong vòng 20 lần tiếp đời kể từ đời P130.
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
5.1. KẾT LUẬN
Về đặc tính ổn định hiệu giá:
Giống virus AVAC/VR/PED.98và AVAC/VR/TGE.15 có đặc tính ổn định
hiệu giá, với mức dao động từ 7,1 đến 7,5 log10 TCID50/ ml (PEDV) và 8,5 đến
8,7 log10 TCID50/ ml (TGEV).
Về đặc tính nhƣợc độc:
- Chủng giống AVAC/VR/PED.98 và AVAC/VR/TGE.15 không gây
bệnh cho lợn thậm chí ở giai đoạn mẫn cảm nhất.
- So với chủng virus cường độc, cả 2 chủng virus nhược độc nhân lên một cách hạn chế ở đường tiêu hóa và thời gian bài thải qua phân chậm hơn.
Về đặc tính ổn định di truyền:
Trong vòng 20 lần tiếp đời, chủng giống virus AVAC/VR/PED.98 và AVAC/VR/TGE.15 có tính ổn định trình tự gen quyết định kháng nguyên chính.
5.2. KIẾN NGHỊ
Tiếp tục nghiên cứu đặc tính của chủng giống AVAC/VR/PED.98 (P100)
và AVAC/VR/TGE.15 (P130) ở các khía cạnh: (i) đặc tính nhược độc ở lợn nái
và lợn thịt; (ii) đặc tính sinh miễn dịch và khả năng bảo hộ chéo với các chủng
TÀI LIỆU THAM KHẢO
I. Tài liệu tiếng Việt:
1. Huỳnh Minh Trí, Nguyễn Hoàng Việt và Nguyễn Ngọc Hải, (2017). Khảo sát tỷ
lệ nhiễm virus gây bệnh tiêu chảy cấp (porcine epidemic diarhea virus - PEDV) trên heo nái và xác định các yếu tố nguy cơ liên quan đến bệnh PED tại tỉnh Tiền Giang. Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ. 52. tr. 1-7.
2. Lê Văn Phan, Nguyễn Trung Tiến, Vũ Thị Thu Hằng, Huỳnh Thị Mỹ Lệ và Nguyễn
Bá Hiên, (2015). Một số đặc điểm sinh học phân tử của virus gây ra dịch tiêu chảy cấp ở lợn (porcine epidemic diarrhea - PED) tại Quảng Trị, Thái Nguyên và Thái Bình từ năm 2013 - 2014. Tạp chí Khoa học và Phát triển. 13. (7). tr. 1089-1100.
3. Nguyễn Tất Toàn và Đỗ Tiến Duy (2012). Đặc trưng kiểu gen của virus gây bệnh
tiêu chảy cấp (PEDV) trên heo ở một số tỉnh miền Đông Nam Bộ. Khoa học Kĩ thuật Thú y. 19. (7). tr. 34-41.
4. Nguyễn Thị Hoa, Nguyễn Thị Lan, Trương Quang Lâm, Trịnh Đình Thâu và Ngô
Thị Hạnh, (2018). Nghiên cứu phân lập và xác định một số đặc điểm sinh học của virus PED (porcine epidemic diarrhea virus). Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam. 16. (3). tr. 257-267.
5. Nguyễn Văn Điệp, Nguyễn Thị Lan, Nguyễn Thị Hoa và R. Yamaguchi (2014).
Một số đặc điểm dịch tễ và bệnh lý của bệnh tiêu chảy thành dịch trên heo ở một số tỉnh phía Bắc Việt Nam. Khoa học Kĩ thuật Thú y. 21. (2). tr. 43-55.
6. Vũ Thị Lan Hương, (2007). Nghiên cứu tình hình phơi nhiễm các virus transmissible gastroenteritis virus (TGEV), porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) và rotavirus (RV) ở lợn bằng phương pháp Ab-ELISA. Luận văn thạc sĩ nông nghiệp, Trường đại học Nông nghiệp I.
II. Tài liệu tiếng Anh:
1. An Kang, Liurong Fang, Rui Luo, Dang Wang, Lilan Xie, Jing Yang, Huanchun
Chen and Shaobo Xiao, (2014). Quantitative proteomic analysis reveals that transmissible gastroenteritis virus activates the JAK-STAT1 signaling pathway.
2. Barrera Maritza, Ana Garrido-Haro, Mar Vaca, #xed, a S., Danilo Granda, Alfredo Acosta-Batallas, #xe9 and Lester J. rez, (2017). Tracking the Origin and Deciphering the Phylogenetic Relationship of Porcine Epidemic Diarrhea Virus in Ecuador. BioMed Research International. 2017. 7.
3. Bernard Serge and Hubert Laude, (1995). Site-specific alteration of transmissible gastroenteritis virus spike protein results in markedly reduced pathogenicity. Journal of general virology. 76. (9). pp. 2235-2241.
4. Bernasconi C, F Guscetti, A Utiger, K van Reeth, M Ackermann and A
Pospischil, 1995: Experimental infection of gnotobiotic piglets with a cell culture adapted porcine epidemic diarrhoea virus: clinical, histopathological and immunohistochemical findings. Immunobiology of viral infections. Proceedings 3rd Congress of the European Society for Veterinary Virology Interlaken, Switzerland, 4-7 September, 1994. pp. 542-546. Foundation Marcel Merieux. 5. Bohl Edward H and Linda J Saif, (1975). Passive immunity in transmissible
gastroenteritis of swine: immunoglobulin characteristics of antibodies in milk after inoculating virus by different routes. Infection and immunity. 11 (1): 23-32.
6. Boonsoongnern Prapassorn, Alongkot Boonsoongnern, Urai Pongchairerk and
Tanatpon Paompa, (2018). The comparison of villous damage at different ages of piglets infected with porcine epidemic diarrhea virus. Chiang Mai Veterinary Journal. 16. (1). pp. 37-46.
7. Callebaut P, P Debouck and M Pensaert, (1982). Enzyme-linked immunosorbent
assay for the detection of the coronavirus-like agent and its antibodies in pigs with porcine epidemic diarrhea. Veterinary microbiology. 7. (4). pp. 295-306.
8. Carvajal Ana, Ignacio Lanza, Rafael Diego, Pedro Rubio and Pedro Cámenes, (1995). Evaluation of a blocking ELISA using monoclonal antibodies for the detection of porcine epidemic diarrhea virus and its antibodies. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 7. (1). pp. 60-64.
9. Chang Sun-Hwa, Jong-Lye Bae, Tae-Jin Kang, Ju Kim, Gook-Hyun Chung, Chae- Woong Lim, Hubert Laude, Moon-Sik Yang and Yong-Suk Jang, (2002). Identification of the epitope region capable of inducing neutralizing antibodies against the porcine epidemic diarrhea virus. Molecules and cells. 14 (2). pp. 295-299.
10. Chang Y. C., C. F. Kao, C. Y. Chang, C. R. Jeng, P. S. Tsai, V. F. Pang, H. Y. Chiou, J. Y. Peng, I. C. Cheng and H. W. Chang, (2017). Evaluation and Comparison of the Pathogenicity and Host Immune Responses Induced by a G2b Taiwan Porcine Epidemic Diarrhea Virus (Strain Pintung 52) and Its Highly Cell- Culture Passaged Strain in Conventional 5-Week-Old Pigs. Viruses. 9. (5).
11. Chen Qi, Ganwu Li, Judith Stasko, Joseph T Thomas, Wendy R Stensland, Angela E Pillatzki, Phillip C Gauger, Kent J Schwartz, Darin Madson and Kyoung-Jin Yoon, (2014). Isolation and characterization of porcine epidemic diarrhea viruses associated with the 2013 disease outbreak among swine in the United States. Journal of clinical microbiology. 52. (1). pp. 234-243.
12. Choe Se-Eun, Kee-Hwan Park, Seong-In Lim, Nguyen Ba Hien, Pham Ngoc Thach,
Byung-Hyun An, Song Hee Han, In-Soo Cho and Dong-Jun An, (2016). Complete genome sequence of a porcine epidemic diarrhea virus strain from Vietnam, HUA- 14PED96, with a large genomic deletion. Genome Announc. 4 (1): e00002-00016. 13. Cubero M. J., S. Bernard, L. Leon, P. Berthon and A. Contreras, (1992).
Pathogenicity and antigen detection of the Nouzilly strain of transmissible gastroenteritis coronavirus, in 1-week-old piglets. Journal of Comparative Pathology. 106. (1). pp. 61-72.
14. De Arriba ML, A Carvajal, J Pozo and P Rubio, (2002). Mucosal and systemic isotype-specific antibody responses and protection in conventional pigs exposed to virulent or attenuated porcine epidemic diarrhoea virus. veterinary immunology and immunopathology. 85. (1-2). pp. 85-97.
15. Debouck P and M Pensaert, (1980). Experimental infection of pigs with a new porcine enteric coronavirus, CV 777. American journal of veterinary research. 41 (2). pp. 219-223.
16. Deng Feng, Gang Ye, Qianqian Liu, Muhammad Navid, Xiaoli Zhong, Youwen Li, Chunyun Wan, Shaobo Xiao, Qigai He and Zhen Fu, (2016). Identification and comparison of receptor binding characteristics of the spike protein of two porcine epidemic diarrhea virus strains. Viruses. 8 (3). pp. 55.
17. Diep N. V., M. Sueyoshi, U. Izzati, N. Fuke, A. P. P. Teh, N. T. Lan and R. Yamaguchi, (2018). Appearance of US-like porcine epidemic diarrhoea virus
(PEDV) strains before US outbreaks and genetic heterogeneity of PEDVs collected in Northern Vietnam during 2012-2015. Transbound Emerg Dis. 65 (1). e83-e93. 18. Doyle LP and LM Hutchings, (1946). A transmissible gastroenteritis in pigs.
Journal of the American Veterinary Medical Association. 108. pp. 257-259.
19. Furuuchi Susumu, Yukio Shimizu and Tetsuo Kumagai, (1979). Multiplication of
low and high cell culture passaged strains of transmissible gastroenteritis virus in organs of newborn piglets. Veterinary Microbiology. 3 (3). pp. 169-178.
20. Gerber Priscilla F., Chao-Ting Xiao, Kelly Lager, Kimberly Crawford, Vikas Kulshreshtha, Dianjun Cao, Xiang-Jin Meng and Tanja Opriessnig, (2016). Increased frequency of porcine epidemic diarrhea virus shedding and lesions in suckling pigs compared to nursery pigs and protective immunity in nursery pigs after homologous re-challenge. Vet Res. 47. (1). pp. 118-118.
21. Goede Dane, Michael P Murtaugh, Joel Nerem, Paul Yeske, Kurt Rossow and Robert Morrison, (2015). Previous infection of sows with a “mild” strain of porcine epidemic diarrhea virus confers protection against infection with a “severe” strain. Veterinary microbiology. 176. (1-2). pp. 161-164.
22. Hall T.A., (1999). BioEdit: A user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucl. Acids. Symp. Ser. 41. pp. 95-98.
23. Have P, V Moving, V Svansson, Åse Uttenthal and B Bloch, (1992). Coronavirus
infection in mink (Mustela vision). Serological evidence of infection with a coronavirus related to transmissible gastroenteritis virus and porcine epidemic diarrhea virus. Veterinary microbiology. 31. (1). pp. 1-10.
24. Hofmann Martin and Robert Wyler, (1988). Propagation of the virus of porcine
epidemic diarrhea in cell culture. Journal of clinical microbiolog y. 26. (11). pp. 2235-2239.
25. Hofmann Martin and Robert Wyler, (1989). Quantitation, biological and
physicochemical properties of cell culture-adapted porcine epidemic diarrhea coronavirus (PEDV). Veterinary microbiology. 20. (2). pp. 131-142.
26. Hou Y. and Q. Wang, (2019). Emerging Highly Virulent Porcine Epidemic Diarrhea Virus: Molecular Mechanisms of Attenuation and Rational Design of Live Attenuated Vaccines. Int J Mol Sci. 20. (21). pp. 5478.
27. Huang Yao-Wei, Allan W Dickerman, Pablo Piñeyro, Long Li, Li Fang, Ross Kiehne, Tanja Opriessnig and Xiang-Jin Meng, (2013). Origin, evolution, and genotyping of emergent porcine epidemic diarrhea virus strains in the United States. MBio. 4 (5). e00737-00713.
28. Kemeny LJ, (1976). Antibody response in pigs inoculated with transmissible gastroenteritis virus and cross reactions among ten isolates. Canadian Journal of Comparative Medicine. 40 (2). pp. 209.
29. Kemeny LJ, VL Wiltsey and JL Riley, (1975). Upper respiratory infection of lactating sows with transmissible gastroenteritis virus following contact exposure to infected piglets. The Cornell Veterinarian. 65. (3). pp. 352-362.
30. Kim B. and C. Chae, (2002a). Experimental Infection of Piglets with Transmissible Gastroenteritis Virus: a Comparison of Three Strains (Korean, Purdue and Miller). Journal of Comparative Pathology. 126. (1). pp. 30-37.
31. Kim Okjin and Chanhee Chae, (2002b). Comparison of reverse transcription polymerase chain reaction, immunohistochemistry, and in situ hybridization for the detection of porcine epidemic diarrhea virus in pigs. Canadian journal of veterinary research. 66. (2). pp. 112.
32. Kim Seong-Hee, Jung-Min Lee, Jongsun Jung, In-Joong Kim, Bang-Hun Hyun, Hyun-Il Kim, Choi-Kyu Park, Jae-Ku Oem, Yeon-Hee Kim and Myoung-Heon Lee, (2015). Genetic characterization of porcine epidemic diarrhea virus in Korea from 1998 to 2013. Archives of virology. 160. (4). pp. 1055-1064.
33. Kim Yonghyan, Venkatramana Krishna, Montserrat Torremorell, Sagar Goyal and Maxim Cheeran, (2018). Stability of Porcine Epidemic Diarrhea Virus on Fomite Materials at Different Temperatures. Veterinary sciences. 5. (1). pp. 21. 34. Krempl Christine, Beate Schultze, Hubert Laude and Georg Herrler, (1997). Point
mutations in the S protein connect the sialic acid binding activity with the enteropathogenicity of transmissible gastroenteritis coronavirus. Journal of Virology. 71. (4). pp. 3285-3287.
35. Kumar S., G. Stecher and K. Tamura, (2016). MEGA7: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 7.0 for Bigger Datasets. Mol Biol Evol. 33. (7). pp. 1870-1874.
36. Kusanagi Ko-ichi, Hiroyoshi Kuwahara, Tetsuo Katoh, Tetsuo Nunoya, Yoshihisa Ishikawa, Togo Samejima and Masanori Tajama, (1992). Isolation and serial propagation of porcine epidemic diarrhea virus in cell cultures and partial characterization of the isolate. Journal of Veterinary Medical Science. 54 (2). pp. 313-318.
37. Kweon Chang-hee, Byung-joon Kwon, Tae-sung Jung, Young-jin Kee, Dong-ho
Hur, Eui-kyung Hwang, Jae-chin Rhee and Soo-hwan An, (1993). Isolation of porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) in Korea. Korean Journal of Veterinary Research. 33. (2). pp. 249-254.
38. Laude Hubert, Jacqueline Gelfi, Laurence Lavenant and Bernard Charley, (1992). Single amino acid changes in the viral glycoprotein M affect induction of alpha interferon by the coronavirus transmissible gastroenteritis virus. Journal of virology. 66. (2). pp. 743-749.
39. Laude Hubert, Denis Rasschaert, Bernard Delmas, Murielle Godet, Jacqueline Gelfi and Bernard Charley, (1990). Molecular biology of transmissible gastroenteritis virus. Veterinary microbiology. 23. (1-4). pp. 147-154.
40. Lee S., Y. Kim and C. Lee, (2015). Isolation and characterization of a Korean porcine epidemic diarrhea virus strain KNU-141112. Virus Res. 208 215-224. 41. Lee S., K. Y. Son, Y. H. Noh, S. C. Lee, H. W. Choi, I. J. Yoon and C. Lee,
(2017). Genetic characteristics, pathogenicity, and immunogenicity associated with cell adaptation of a virulent genotype 2b porcine epidemic diarrhea virus. Vet Microbiol. 207. pp. 248-258.
42. Leidenberger S., C. Schroder, L. Zani, A. Auste, M. Pinette, A. Ambagala, V. Nikolin, H. de Smit, M. Beer and S. Blome, (2017). Virulence of current German PEDV strains in suckling pigs and investigation of protective effects of maternally derived antibodies. Sci Rep. 7. (1). pp. 10825.