Phần 2 Tổng quan tài liệu
2.2. Giới thiệu chung về virus gây tiêu chảy
2.2.3. Virus gây bệnh tiêu chảy cấp ở lợn
2.2.3.1. Cấu trúc phân tử của PEDV
PEDV là virus có vỏ ngoài bao bọc, đường kính biến đổi từ 90 đến 190 nm. Virus có mộtnhân đậm đặc điện tử với quầng sáng ở giữa và những phần tỏa ra từ nhân dạng chùy dài xấp xỉ 20nm. Virus nhân lên thông qua việc nẩy chồi từ các màng bên trong bào tương tế bào vật chủ. Bộ gen của virus PED là RNA dạng sợi đơn dương kích thước khoảng 28kb với mũ 5’ và đuôi là polyA 3’. Bộ gen của virus gồm một vùng không dịch mã đầu (UTR) 5’, một UTR đầu 3’, có ít nhất 7 khung đọc mở (ORF) mã hóa cho 4 protein cấu trúc gồm gai (S), vỏ (E), màng (M), và nucleocapsid (N) và 3 protein không cấu trúc (enzyme tái bản replicase 1a, 1b và ORF3). Những khung đọc mở này được sắp xếp theo trình tự: 5’-replicase (1a, 1b)-S-ORF3-E-M-N-3’. Protein cấu trúc của PEDV tương tự
như các coronavirus khác. Virus có một protein gai (S) với trọng lượng phân tử khoảng 180-200 kDa, một protein màng (M) 27-32 kDa, một protein nucleocapsid gắn với RNA nặng 57-58 kDa. Hai khung đọc mở ORF (Open Reading Frame - ORF) 1a và 1b, chiếm 2/3 bộ gen tính từ đầu 5’ mã hoá cho các protein phi cấu trúc (replicase 1a và 1b). ORF1 là sản phẩm của việc sao chép polyprotein 1a trong khi ORF1b được biểu thị bằng sự dịch chuyển khung ribosome −1 (RFS). Gen ORF3 là một gen phụ trợ, nằm giữa các gen cấu trúc, nó mã hóa cho 1 protein bổ trợ, các coronavirus khác nhau có số lượng và trình tự gen khác nhau.
Hình 2.7.Cấu trúc bộ gen của PEDV
Ghi chú: Sơ đồ của tổ chức bộ gen PEDV và các miền suy ra của protein S, bao gồm một đoạn peptide tín hiệu (SP); Vùng S1, bao gồm S1-NTD (21 - 32) và S1-CTD (253-638); Vùng S2; miền xuyên màng
(TM); và đuôi tế bào chất (Cyto)
Nguồn: Deng et al. (2016). Protein S của PEDV là một loại gai glycoprotein (kháng nguyên bề mặt) trên bề mặt virus, đóng vai trò quan trọng trong việc điều hoà tương tác với các glycoprotein thụ thể đặc hiệu trên tế bào vật chủ trong quá trình xâm nhập, kích thích tạo kháng thể trung hoà ở vật chủ tự nhiên(Chang et al., 2002). Protein S có kích thước 1.383 amino acids, bao gồm một gồm một đoạn peptide tín hiệu (1- 20aa); một vùng S1 (21 - 793 aa) có tác dụng gắn kết các hạt virus vớicác thụ thể bề mặt tế bào; một vùng S2 (794 - 1385 aa) làm trung gian phản ứng tổng hợp virus với các tế bào chủ; một miền xuyên màng (1335 - 1358) và đuôi tế bào chất (1359 - 1385); Khu vực S1 chứa hai miền phụ là S1-NTD (21 - 324aa) và S1- CTD (253 - 638 aa).Vùng S1 của các coronavirus chứa miền liên kết với thụ thể, có vai trò trong quá trình tương tác với các thụ thể tế bào để gắn virus. Miền đầu cuối N của miền S1 cần thiết trong quá trình liên kết thụ thể. Protein S liên quan tới sự thích nghi sinh trưởng trong điều kiện phòng thí nghiệm và sự giảm độc
lực khi gây bệnh trên động vật, ngoài ra gen S còn được sử dụng để đánh giá mối quan hệ di truyền cũng như sự tiến hóa của các chủng virus PED đang lưu hành. Các biến thể di truyền của coronavirus tập trung ở phần S1 của gen S. Đột biến, xóa và / hoặc chèn trong protein S có thể thay đổi khả năng gây bệnh và tính kháng nguyên. Chính vì vậy, trong nghiên cứu chế tạo vacxin phòng bệnh, hiện tại các nhà khoa học chủ yếu tập trung vào glycoprotein này. (Sun et al.,
2015)báo cáo rằng một chủng CHN / FL2013 với việc loại bỏ 7 aa của protein S làm giảm độc lực của virus trong nuôi cấy tế bào. Một nghiên cứu khác về chủng MF3809 / 2008 của Hàn Quốcđã chỉ ra rằng bằng việc xóa 204 aa tại các vị trí axit amin 713 - 916 của protein S làm giảm độc lực virus và thay đổi hướng mô từ ruột. Trong những năm gần đây, các chủng đột biến S mới đã liên tục được tìm thấy và điều này có thể liên quan đến áp lực miễn dịch của các loại vacxin được sử dụng, bao gồm cả các chủng từ các chủng vacxin CV777 và DR13.
Gen ORF3 nằm giữa gen S và E trong bộ gen PEDV, là gen mã hoá cho protein không cấu trúc và là protein phụ trợ, gen này không cần thiết cho quá trình nhân lên của PEDV.Tuy nhiên nghiên cứu của(Ye et al., 2015) cho thấy, PEDV trong quá trình cấy chuyển nhiều lần trên tế bào dẫn đến 1 nucleotite 49 hoặc 51 ở vùng gen ORF3 bị xóa có liên quan đến đọc lực của virus. Nghiên cứu còn chứng minh rằng gen ORF3 của PEDV có thể kéo dài pha S tạo điều kiện cho sự hình thành tiểu bào và do đó thúc đẩy sự tăng sinh của PEDV. Sự khác biệt của gen ORF3 cũng được thấy rõ giữa các chủng thực địa và các chủng nuôi cấy trong phòng thí nghiệm(Park et al., 2008; Wongthida et al., 2017).
Protein M nằm trên bề mặt của virus, là thành phần vỏ lớn nhất của virus PED, glycoprotein cấu trúc màng với một đầu tận cùng gắn amin ngắn phía ngoài virus và một đầu tận cùng gắn carboxy ở bên trong (Bernasconi et al., 1995). Protein M đóng vai trò quan trọng trong quá trình lắp ráp virus(Nguyen & Hogue, 1997)ngoài ra protein M còn tạo ra kháng thể trung hoà virus với sự có mặt của bổ thể(Saif, 1993). Protein M kích thích quá trình tạo ra α-
interferon(Laude et al., 1992). Việc đồng thời biểu hiện protein M và N cho phép
tạo thành các hạt giả virus có khả năng biểu lộ hoạt tính sinh interferon tương tự như hạt virus hoàn chỉnh. Nghiên cứu về glycoprotein M sẽ làm tăng thêm hiểu biết về mối quan hệ di truyền, sự đa dạng giữa các chủng PEDV và tình trạng dịch tễ của PEDV trên thực địa(Wang et al., 2010).
Protein N của coronavirus tương tác với genARN virus và liên kết với các phân tử protein N khác để bảo vệ bộ gen của virus, là kháng nguyên chiếm ưu thế được sản xuất trong các tế bào bị nhiễm coronavirus. Protein N có vai trò quan trọng đối với phản ứng miễn dịch qua trung gian tế bào, làm kéo dài giai đoạn S của chu kỳ tế bào nó còn là nguyên nhân gây stress lưới nội chất đồng thời làm tăng NF-kB, Bcl-2 và interleukin 8 (Xu et al., 2013b). Ngoài ra protein này rất hữu ích cho việc chẩn đoán sớm và chính xác nhiễm trùng do PEDV.
Các nghiên cứu trước đây cho thấy protein E cùng với protein M đóng vai trò quan trọng trong quá trình lắp ráp virus. Nó đóng vai trò của một kênh ion ảnh hưởng đến việc phát tán virus, đa số protein E nằm trong lưới nội chất, với số lượng nhỏ được nằm trong nhân. Protein E không ảnh hưởng đến sự phát triển của tế bào biểu mô ruột (IEC) và chu kỳ tế bào nhưng nó góp phần gây stress lưới nội chất đồng thời làm tăng interleukin 8 (Xu et al., 2013a).
2.2.3.2. Đặc tính nuôi cấy
Việc nuôi cấy virus trong điều kiện phòng thí nghiệm thời gian đầu gặp rất nhiều khó khăn mặc dù đã thử nghiệm nuôi cấy trên nhiều loại tế bào nhưng tỉ lệ thành công là rất thấp. Việc phân lập virus có ý nghĩa rất quan trọng trong việc chẩn đoán bệnh, dịch tễ học, và công tác quản lý dịch bệnh.
Khả năng thích ứng của virus PED với tế bào ruột non trong điều kiện của phòng thí nghiệm rất kém. Quá trình sinh trưởng của virus PED trên môi trường nuôi cấy tế bào hết sức khó khăn. Với các tế bào không được xử lý với trypsin hoặc dịch tụy thì không thích hợp để virus nhân lên và virus có thể dần mất khả
năng gây nhiễm khi cấy truyền ở các đời xa hơn(Callebaut et al., 1982). Hiện nay
tế bào Vero là dòng tế bào thích hợp nhất để phân lập và nhân giống virus PED trong phòng thí nghiệm (một dòng tế bào tách từ tế bào thận khỉ xanh châu Phi). Ngoài ra, PEDV đã được nhân lên thành công trên các tế bào thận lợn và bàng
quang lợn ở Nhật Bản(Shibata et al., 2000). Chủng virus phân lập tại Nhật Bản
(P-5V) đã được sử dụng làm chủng virus vacxin và được nuôi cấy trên các dòng tế bào lợn KSEK6 và IB -R.
Một vacxin khác dùng cho lợn con bú mẹ có thể chế từ virus giảm độc lực thu được qua việc cấy chuyển nhiều đời (93 đời cấy chuyển) của virus PED trên môi trường nuôi cấy tế bào Vero (Kweon et al., 1993). Ở Nhật Bản, một loại
tế bào nuôi cấy đã được sử dụng phòng bệnh cho nái từ năm 1997. Mặc dù những vacxin này được xem là khá hiệu quả, tuy nhiên không phải tất cả lợn nái sử dụng vacxin đều tạo được miễn dịch qua sữa ổn định.
Nghiên cứu cấy chuyển PEDV trong môi trường tế bào Vero, (Hofmann
and Wyler, 1988); (Kusanagi et al., 1992)đã tiến hành cấy chuyển 3 đời liên tiếp
PEDV trong môi trường tế bào Vero có bổ sung 10 µg/ml trypsin(Chen et al., 2014, Kweon et al., 1993) đã tiến hành cấy chuyển 4 đời liên tiếp trong môi trường tế bào Vero có bổ sung 5 µg/ml trypsin (Chang et al., 2002) cấy chuyển 5 đời liên tiếp trong môi trường không bổ sung trypsin(Pan et al., 2012) cấy chuyển 7 đời liên tiếp trong môi trường có bổ sung 10 µg/ml trypsin. Quan sát sự thích ứng nhân lên của PEDV qua các đời cấy chuyển(Hofmann and Wyler, 1988)đã thấy rằng: Đời phân lập đầu tiên CPE xuất hiện sau 3-5 ngày gây nhiễm và tế bào bị phá hủy hoàn toàn sau 2 ngày kể từ khi xuất hiện bệnh tích tế bào và sau 4 đời cấy chuyển liên tiếp thì tế bào bị phá hủy hoàn toàn sau 96 giờ (4 ngày), bệnh tích tế bào (CPE) (đặc trưng bởi các đám tế bào bị dung giải màng, nhân tế bào co cụm lại với nhau hình thành các thể hợp bào). Hiệu giá virus đạt tối đa sau khi nuôi cấy 15 giờ. Năm 2018, (Nguyễn Thị Hoa và cs., 2018) đã tiến hành nuôi cấy, phân lập PEDV trên tế bào Vero và quan sát CPE của chúng, Kết quả, ở đời phân lập đầu tiên CPE thường được quan sát thấy trong vòng 12 - 24 giờ và tế bào bị phá hủy hoàn toàn sau 48 giờ gây nhiễm. Trong khi đó đời cấy chuyển P4 bệnh tích tế bào xuất hiện sớm hơn 8 - 12 giờ sau gâynhiễm và tế bào bị phá hủy hoàn toàn sau 36 giờ gây nhiễm (Hình 2.8).
Hình 2.8. Bệnh tích tế bào do PEDV gây ra trên ra trên tế bào Vero
Ghi chú: CPE sau 24 giờ gây nhiễm PEDV (E), CPE sau 36 giờ gây nhiễm PEDV (F)
Năm 2011,(Sato et al., 2011) đã nghiên cứu cấy chuyển chủng PEDV 83P-5 trong các tế bào Vero dẫn đến sự thích nghi tăng trưởng của virus trong các tế bào Vero ở đời thứ 22, tiếp tục cấy chuyển cho đến đời thứ 100 và phân tích các thay đổi về đột biến gen (S), màng (M) và nucleocapsid (N) và khả năng gây bệnh của virus ở đời 34, thứ 61 và 100. Kết quả phân tích trình tự cho thấy đột biến xảy ra ở đời 34 và 61 đã được chuyển sang đời thứ 100. Ngược lại, các gen M và N của virus cho thấy sự bảo tồn mạnh mẽ trong quá trình truyền nối tiếp.
Nghiên cứu tác dụng ức chế của gen phụ trợ ORF3 đối với sự sao chép PEDV trong ống nghiệm cho thấy ORF3 có vai trò quan trọng trong quá trình ức chế sự phiên mã của PEDV trong quá trình nuôi cấy tế bào. Sự vắng mặt hoặc các biến thể căt ngắn của ORF3 có liên quan đến sự suy giảm của virus trong cơ thể sống. Nghiên cứu của(Wongthida et al., 2017) đã chứng minh ORF3NP12 (biến thể của ORF3) có thể ức chế sự phục hồi của PEDV bằng cách ức chế sự phiên mã của PEDV. Gây đột biến các axit amin của ORF3NP12 cho thấy axit amin F81L có vai trò trong việc làm suy yếu PEDV trong nuôi cấy. Sử dụng các tế bào HEK293T đồng bộ hóa với 1 lg pMD2-ORF3 và 1 lg của pPEDV- mCherry trong trường hợp không có trypsin. Sau 72 h tiến hành thu phần dịch
nổi bên trên và hấp phụ lên các tế bào VeroE6-APN. Kết quả cho thấy các tế bào
bị nhiễm PEDV – ORF3 NP12F81L đã giải phóng virus và virus được nhân lên trong các tế bào Vero E6-APN và cho thấy sự hình thành hợp bào còn chủng ORF2NP12 không thấy sự nhân lên của virus trong tế bào (Hình 2.9).
Hình 2.9. CPE của PEDV mang đột biến gen ORF3
2.2.3.3. Sức đề kháng của virus
Virus ổn định trong nhiệt độ thấp song rất dễ bị phá hủy ở điều kiện nhiệt độ phòng. Ở nhiệt độ âm sâu sau 1 năm hiệu giá virus giảm không đáng kể, ở
370C sau 4 ngày virus mất hoàn toàn khả năng gây nhiễm.
Virus mẫn cảm với ether, chloroform và desoxycholate. Trong 0,5% phenol, 0,05% formandehyde virus bị bất hoạt trong 30 phút.
Virus kháng với trypsin, ổn định trong mật lợn và pH, do đặc tính đó lên virus sống được trong dạ dày và ruột non.PEDV ổn định giữa pH 5 – 9 tại 4oC,giữa pH 6,5 – 7,5 tại 37 oC và bị bất hoạt khi pH < 4 và pH > 9.Trong môi trường nuôi cấy thích nghi, virus bị mất khả năng lây nhiễm ở nhiệt độ 60
oCtrong vòng 30 phút, nhưng ổn định ở 50 oC (Hofmann and Wyler, 1989).
Hình 2.10. Hiệu giá của PEDV tồn tại trên bề mặt vật liệu theo thời gian
Nguồn: Kim et al. (2018)
Đánh giá sự tồn tại của PEDV trênđồ vật thường xuyên sử dụng trong các trang trại lợn như xốp, cao su, nhựa, quần áo,và các thiết bị khác cho thấy hiệu giá của PEDV ở 4°C chỉ giảm 1 đến 2log trong 5 ngày đầu và virus đã có thể phục hồi được sau15 ngày trên xốp, nhôm, tyvek coverall,vải và nhựa. Tuy
nhiên, hiệu giá virus giảm nhanh chóng khi được bảo quản ở nhiệt độ phòng, không phát hiện thấy virus sau một ngày trên tất cả các vật liệu được thử nghiệm. Như vậy, các loại vật liệu fomite và nhiệt độ ảnh hưởng đến sự ổn định của
PEDV(Kim et al., 2018).
2.2.3.4. Bệnh tích của lợn sau khi gây nhiễm PEDV
Năm 2019, (Won et al., 2019) đã tiến hành gây nhiễm chủng PEDV Aram-
P5, Aram-P29-CA (chủng thích nghi với điều kiện lạnh) đường miệng với liều 1
ml 10 4,0 TCID 50 / ml cho lợn con. Kết quả cho thấy lợn ở gây nhiễm Aram-P5
chết sau 5h gây nhiễm, lợn gây nhiễm chủng Aram-P29-CA thích nghi lạnh không có triệu chứng lâm sàng liên quan đến PEDV cũng như không bị chết trong suốt quá trình thí nghiệm.
Hình 2.11. Bệnh tích đại thể và vi thể của lợn con gây nhiễm PEDV
Những con lợn bị nhiễm Aram-P5 cho thấy những tổn thương giống như PED nguyên mẫu, ruột non của chúng bị giãn ra với dịch phân tích tụ màu vàng nhạt và có thành mỏng trong suốt, ngược lại, tất cả lợn gây nhiễm Aram-P29-CA đều không có tổn thương bệnh lý rõ rệt ở đường tiêu hóa với độ dày thành ruột
bình thường (Hình 2.11B), có thể so sánh với lợn trong nhóm đối chứng âm tính. Bệnh tích vi thể cho thấy tế bào nhung mao ruột bị rút ngắn lại, khi nhuộm IHC cho thấy kháng nguyên xuất hiện ởtế bào biểu mô không tràng của của lợn gây nhiễm chủng PEDV Aram - P5, trong khi lợn ở nhóm Aram-P29-CA tế bào nhung mao ruột bình thường và không phát hiện được kháng nguyên có trong tế bào biểu mô.