Ghi chú: Sơ đồ của tổ chức bộ gen PEDV và các miền suy ra của protein S, bao gồm một đoạn peptide tín hiệu (SP); Vùng S1, bao gồm S1-NTD (21 - 32) và S1-CTD (253-638); Vùng S2; miền xuyên màng
(TM); và đuôi tế bào chất (Cyto)
Nguồn: Deng et al. (2016). Protein S của PEDV là một loại gai glycoprotein (kháng nguyên bề mặt) trên bề mặt virus, đóng vai trò quan trọng trong việc điều hoà tương tác với các glycoprotein thụ thể đặc hiệu trên tế bào vật chủ trong quá trình xâm nhập, kích thích tạo kháng thể trung hoà ở vật chủ tự nhiên(Chang et al., 2002). Protein S có kích thước 1.383 amino acids, bao gồm một gồm một đoạn peptide tín hiệu (1- 20aa); một vùng S1 (21 - 793 aa) có tác dụng gắn kết các hạt virus vớicác thụ thể bề mặt tế bào; một vùng S2 (794 - 1385 aa) làm trung gian phản ứng tổng hợp virus với các tế bào chủ; một miền xuyên màng (1335 - 1358) và đuôi tế bào chất (1359 - 1385); Khu vực S1 chứa hai miền phụ là S1-NTD (21 - 324aa) và S1- CTD (253 - 638 aa).Vùng S1 của các coronavirus chứa miền liên kết với thụ thể, có vai trò trong quá trình tương tác với các thụ thể tế bào để gắn virus. Miền đầu cuối N của miền S1 cần thiết trong quá trình liên kết thụ thể. Protein S liên quan tới sự thích nghi sinh trưởng trong điều kiện phòng thí nghiệm và sự giảm độc
lực khi gây bệnh trên động vật, ngoài ra gen S còn được sử dụng để đánh giá mối quan hệ di truyền cũng như sự tiến hóa của các chủng virus PED đang lưu hành. Các biến thể di truyền của coronavirus tập trung ở phần S1 của gen S. Đột biến, xóa và / hoặc chèn trong protein S có thể thay đổi khả năng gây bệnh và tính kháng nguyên. Chính vì vậy, trong nghiên cứu chế tạo vacxin phòng bệnh, hiện tại các nhà khoa học chủ yếu tập trung vào glycoprotein này. (Sun et al.,
2015)báo cáo rằng một chủng CHN / FL2013 với việc loại bỏ 7 aa của protein S làm giảm độc lực của virus trong nuôi cấy tế bào. Một nghiên cứu khác về chủng MF3809 / 2008 của Hàn Quốcđã chỉ ra rằng bằng việc xóa 204 aa tại các vị trí axit amin 713 - 916 của protein S làm giảm độc lực virus và thay đổi hướng mô từ ruột. Trong những năm gần đây, các chủng đột biến S mới đã liên tục được tìm thấy và điều này có thể liên quan đến áp lực miễn dịch của các loại vacxin được sử dụng, bao gồm cả các chủng từ các chủng vacxin CV777 và DR13.
Gen ORF3 nằm giữa gen S và E trong bộ gen PEDV, là gen mã hoá cho protein không cấu trúc và là protein phụ trợ, gen này không cần thiết cho quá trình nhân lên của PEDV.Tuy nhiên nghiên cứu của(Ye et al., 2015) cho thấy, PEDV trong quá trình cấy chuyển nhiều lần trên tế bào dẫn đến 1 nucleotite 49 hoặc 51 ở vùng gen ORF3 bị xóa có liên quan đến đọc lực của virus. Nghiên cứu còn chứng minh rằng gen ORF3 của PEDV có thể kéo dài pha S tạo điều kiện cho sự hình thành tiểu bào và do đó thúc đẩy sự tăng sinh của PEDV. Sự khác biệt của gen ORF3 cũng được thấy rõ giữa các chủng thực địa và các chủng nuôi cấy trong phòng thí nghiệm(Park et al., 2008; Wongthida et al., 2017).
Protein M nằm trên bề mặt của virus, là thành phần vỏ lớn nhất của virus PED, glycoprotein cấu trúc màng với một đầu tận cùng gắn amin ngắn phía ngoài virus và một đầu tận cùng gắn carboxy ở bên trong (Bernasconi et al., 1995). Protein M đóng vai trò quan trọng trong quá trình lắp ráp virus(Nguyen & Hogue, 1997)ngoài ra protein M còn tạo ra kháng thể trung hoà virus với sự có mặt của bổ thể(Saif, 1993). Protein M kích thích quá trình tạo ra α-
interferon(Laude et al., 1992). Việc đồng thời biểu hiện protein M và N cho phép
tạo thành các hạt giả virus có khả năng biểu lộ hoạt tính sinh interferon tương tự như hạt virus hoàn chỉnh. Nghiên cứu về glycoprotein M sẽ làm tăng thêm hiểu biết về mối quan hệ di truyền, sự đa dạng giữa các chủng PEDV và tình trạng dịch tễ của PEDV trên thực địa(Wang et al., 2010).
Protein N của coronavirus tương tác với genARN virus và liên kết với các phân tử protein N khác để bảo vệ bộ gen của virus, là kháng nguyên chiếm ưu thế được sản xuất trong các tế bào bị nhiễm coronavirus. Protein N có vai trò quan trọng đối với phản ứng miễn dịch qua trung gian tế bào, làm kéo dài giai đoạn S của chu kỳ tế bào nó còn là nguyên nhân gây stress lưới nội chất đồng thời làm tăng NF-kB, Bcl-2 và interleukin 8 (Xu et al., 2013b). Ngoài ra protein này rất hữu ích cho việc chẩn đoán sớm và chính xác nhiễm trùng do PEDV.
Các nghiên cứu trước đây cho thấy protein E cùng với protein M đóng vai trò quan trọng trong quá trình lắp ráp virus. Nó đóng vai trò của một kênh ion ảnh hưởng đến việc phát tán virus, đa số protein E nằm trong lưới nội chất, với số lượng nhỏ được nằm trong nhân. Protein E không ảnh hưởng đến sự phát triển của tế bào biểu mô ruột (IEC) và chu kỳ tế bào nhưng nó góp phần gây stress lưới nội chất đồng thời làm tăng interleukin 8 (Xu et al., 2013a).
2.2.3.2. Đặc tính nuôi cấy
Việc nuôi cấy virus trong điều kiện phòng thí nghiệm thời gian đầu gặp rất nhiều khó khăn mặc dù đã thử nghiệm nuôi cấy trên nhiều loại tế bào nhưng tỉ lệ thành công là rất thấp. Việc phân lập virus có ý nghĩa rất quan trọng trong việc chẩn đoán bệnh, dịch tễ học, và công tác quản lý dịch bệnh.
Khả năng thích ứng của virus PED với tế bào ruột non trong điều kiện của phòng thí nghiệm rất kém. Quá trình sinh trưởng của virus PED trên môi trường nuôi cấy tế bào hết sức khó khăn. Với các tế bào không được xử lý với trypsin hoặc dịch tụy thì không thích hợp để virus nhân lên và virus có thể dần mất khả
năng gây nhiễm khi cấy truyền ở các đời xa hơn(Callebaut et al., 1982). Hiện nay
tế bào Vero là dòng tế bào thích hợp nhất để phân lập và nhân giống virus PED trong phòng thí nghiệm (một dòng tế bào tách từ tế bào thận khỉ xanh châu Phi). Ngoài ra, PEDV đã được nhân lên thành công trên các tế bào thận lợn và bàng
quang lợn ở Nhật Bản(Shibata et al., 2000). Chủng virus phân lập tại Nhật Bản
(P-5V) đã được sử dụng làm chủng virus vacxin và được nuôi cấy trên các dòng tế bào lợn KSEK6 và IB -R.
Một vacxin khác dùng cho lợn con bú mẹ có thể chế từ virus giảm độc lực thu được qua việc cấy chuyển nhiều đời (93 đời cấy chuyển) của virus PED trên môi trường nuôi cấy tế bào Vero (Kweon et al., 1993). Ở Nhật Bản, một loại
tế bào nuôi cấy đã được sử dụng phòng bệnh cho nái từ năm 1997. Mặc dù những vacxin này được xem là khá hiệu quả, tuy nhiên không phải tất cả lợn nái sử dụng vacxin đều tạo được miễn dịch qua sữa ổn định.
Nghiên cứu cấy chuyển PEDV trong môi trường tế bào Vero, (Hofmann
and Wyler, 1988); (Kusanagi et al., 1992)đã tiến hành cấy chuyển 3 đời liên tiếp
PEDV trong môi trường tế bào Vero có bổ sung 10 µg/ml trypsin(Chen et al., 2014, Kweon et al., 1993) đã tiến hành cấy chuyển 4 đời liên tiếp trong môi trường tế bào Vero có bổ sung 5 µg/ml trypsin (Chang et al., 2002) cấy chuyển 5 đời liên tiếp trong môi trường không bổ sung trypsin(Pan et al., 2012) cấy chuyển 7 đời liên tiếp trong môi trường có bổ sung 10 µg/ml trypsin. Quan sát sự thích ứng nhân lên của PEDV qua các đời cấy chuyển(Hofmann and Wyler, 1988)đã thấy rằng: Đời phân lập đầu tiên CPE xuất hiện sau 3-5 ngày gây nhiễm và tế bào bị phá hủy hoàn toàn sau 2 ngày kể từ khi xuất hiện bệnh tích tế bào và sau 4 đời cấy chuyển liên tiếp thì tế bào bị phá hủy hoàn toàn sau 96 giờ (4 ngày), bệnh tích tế bào (CPE) (đặc trưng bởi các đám tế bào bị dung giải màng, nhân tế bào co cụm lại với nhau hình thành các thể hợp bào). Hiệu giá virus đạt tối đa sau khi nuôi cấy 15 giờ. Năm 2018, (Nguyễn Thị Hoa và cs., 2018) đã tiến hành nuôi cấy, phân lập PEDV trên tế bào Vero và quan sát CPE của chúng, Kết quả, ở đời phân lập đầu tiên CPE thường được quan sát thấy trong vòng 12 - 24 giờ và tế bào bị phá hủy hoàn toàn sau 48 giờ gây nhiễm. Trong khi đó đời cấy chuyển P4 bệnh tích tế bào xuất hiện sớm hơn 8 - 12 giờ sau gâynhiễm và tế bào bị phá hủy hoàn toàn sau 36 giờ gây nhiễm (Hình 2.8).