Phần 3 Nội dun g nguyên liệ u phƣơng pháp nghiên cứu
3.3. Nội dung nghiên cứu
3.3.1. Đánh giá đặc tính ổn định hiệu giá của PEDV và TGEV 3.3.2. Đánh giá tính nhƣợc độc lực của 2 chủng PEDV và TGEV 3.3.2. Đánh giá tính nhƣợc độc lực của 2 chủng PEDV và TGEV
- Triệu chứng, bệnh tích ở lợn sơ sinh. - Hàm lượng virus thải qua phân.
- Sự phân bố và hàm lượng virus ở đường tiêu hóa.
3.3.3. Đánh giá đặc tính ổn định di truyền của hai chủng PEDV và TGEV
- Giải trình tự gen S của chủng PEDV và TGEV ở các lần tiếp đời xung quanh đời chọn làm vacxin: PEDV (P37, P100, P120, P130, P140 và P150); TGEV (P5, P100, P120, P130, P140 và P150).
- Phân tích trình tự gen S của hai chủng PEDV P100 và TGEV P130. So sánh với trình tự gen tương ứng của các chủng virus vacxin/ cường độc lưu hành trên thế giới.
3.4. ĐỐI TƢỢNG - VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 3.4.1. Đối tƣợng nghiên cứu
- Giống virus TGEV P130, PEDV P100.
3.4.2. Vật liệu nghiên cứu
- Môi trường tế bào Vero và ST (công ty AVAC cung cấp)
- Động vật thí nghiệm: lợn sơ sinh chưa bú sữa đầu; âm tính TGEV, PEDV - Trình tự mồi đặc hiện phát hiện và giải trình tự gen của PEDV, TGEV - Hóa chất tách ARN (TRIzol) và kít tổng hợp cDNA (MMLV)
- Bộ kít PCR (2X PCR Master mix solution, i-MAXⅡ)
- Kit SYBR Green PCR
- Trình tự gen mã hóa protein bề mặt (gen S)
3.5. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.5.1. Phƣơng pháp xác định hiệu giá virus
Hiệu giá của PEDV và TGEV được xác định bằng cách pha loãng virus tới hạn theo cơ số 10 (từ 10-1
đến 10-10) sau đó gây nhiễm lên đĩa 96 giếng có thảm
tế bào Vero (đối với PEDV) và tế bào ST (đối với TGEV). Các bước được tóm tắt như sau:
- Trước khi gây nhiễm, thảm tế bào được rửa 2 lần bằng PBS 1X
-Nhỏ mẫu đã pha loãng vào giếng của đĩa tế bào (100 µl/giếng). Mỗi nồng độ gây nhiễm vào một dãy 3 giếng
- Ủ đĩa ở 37oC trong vòng 1 giờ, sau đó loại bỏ huyễn dịch virus
- Bổ sung môi trường duy trì với thành phần: DMEM + 0,05% yeast extract + 0,3% tryptose phosphate broth + 10 µg/ml trypsin. Môi trường duy trì cho nuôi cấy TGEV có thành phần tương tự với lượng trypsin giảm còn 3µg/ml.
- Đĩa chuẩn độ nuôi trong tủ ấm 37oC, 5% CO2. Hàng ngày theo dõi kết quả bệnh tích tế bào và kết thúc thí nghiệm tại thời điểm 96h sau gây nhiễm. Kết quả được tính theo công thức Spearman-Karber.
Trong đó: L là logarit của độ pha loãng cao nhất có 100% có số giếng huỷ hoại. D là sự chênh lệch log giữa các độ pha loãng mẫu. S là tổng số giếng huỷ hoại ở các độ pha loãng không có 100% số giếng huỷ hoại. N là số giếng gây nhiễm cho mỗi độ pha loãng.
3.5.2. Phƣơng pháp kiểm tra tính nhƣợc độc hóa của virus
Tính độc của PEDV đã được chứng minh với lợn sơ sinh (Thomas et al.,
2015): ở liều thấp (10 ml huyễn dịch virus có hiệu giá trong khoảng 560- 0,056
TCID50/ml) cũng gây ra triệu chứng, bệnh tích. Do đó, nghiên cứu này đã chọn
liều virus của lọ vacxin (105,0 TCID50/ml) để thử độc lực của chủng virus vacxin
ở lợn sơ sinh. Hơn nữa, trong điều kiện Việt Nam, rất khó tìm được trang trại âm tính kháng thể PEDV, do đó, nghiên cứu này chọn lợn sơ sinh (chưa bú sữa đầu) để tiến hành nghiên cứu, thay vì lợn > 5-10 ngày tuổi như một số nghiên cứu (Gerber et al., 2016).
Trước khi gây nhiễm, lợn sơ sinh được điều trị dự phòng nhiễm khuẩn kế phát sử dụng bằng kháng sinh (Baytril 5%) với liều khuyến cáo. Toàn bộ lợn sơ sinh dùng trong nghiên cứu này đã được sàng lọc âm tính với PEDV và TGEV bằng phương pháp RT-PCR. Sau gây nhiễm, quan sát thể trạng của lợn, tình trạng tiêu chảy trong vòng 72 giờ. Tiến hành lấy dịch swab ở hậu môn sau mỗi 12 giờ để nghiên cứu sự bài thải virus.
Tại thời điểm 72 giờ sau nhiễm, toàn bộ lợn được mổ khám theo phương pháp thường quy của Bộ môn Vi sinh vật- Truyền nhiễm. Tiến hành chụp ảnh các bệnh tích đại thể. Để xác định sự phân bố và hàm lượng virus nhân lên ở các đoạn khác nhau của đường tiêu hóa, các đoạn ruột từ tá tràng cho đến trực tràng được lấy và bảo quản riêng rẽ.
Các đoạn khác nhau của đường tiêu hóa cũng được bảo quản trong dung dịch formol trung tính 10% để phục vụ cho làm tiêu bản bệnh lý vi thể. Tiêu bản được làm tại Phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ sinh học, Khoa Thú y.
3.5.3. Phƣơng pháp tách ARN
ARN được tách từ huyễn dịch bệnh phẩm 10%, với các bước như sau: Bước 1: Ly giải mẫu
- Bổ sung 800µl TRIzol vào 200µl huyễn dịch virus, vortex
- Bổ sung tiếp 200µl Chloroform, vortex mạnh trong 15 giây. Ủ ở nhiệt độ phòng 5 phút
Bước 2: Giải phóng ARN
- Chuyển pha trên chứa ARN vào một ống Eppendorf mới (500µl) Bước 3: Kết tủa ARN
- Bổ sung 500µl dung dịch Isopropanol, tủa ở -20oC/ 10 phút
- Ly tâm 12000 vòng/ phút/ 10 phút ở 4oC, bỏ dịch trên, thu tủa ARN
Bước 4: Rửa phần tủa
- Thêm 1ml ethanol 75%. Lắc nhẹ để trộn đều
- Ly tâm 12000 vòng/ phút trong 10 phút ở 4oC
Bước 5: Hoàn nguyên tủa và thu ARN
- Loại bỏ phần dịch phía trên,
- Hòa ARN trong 30µl nước cất 3 lần đã xử lý Rnase và giữ ở -70oC
3.5.4. Phƣơng pháp tổng hợp cDNA
Do virus có bộ gen là ARN, trước khi thực hiện phản ứng PCR, cần chuyển ARN thành ADN (sợi đơn) bằng phản ứng tổng hợp cDNA. Thành phần phản ứng được tóm tắt ở bảng 3.1.
Bảng 3. 1. Thành phần và chu trình nhiệt phản ứng tổng hợp Cdna
TT Thành phần Thể tích (µl) Nhiệt độ (oC) Nhiệt độ ( o C) 1 ARN tổng số 10 65oC/ 5phút; Giữ ở 4oC -
2 Random primer (10 pmole) 2 -
3 dNTPs (40 mM) 1 - 25oC/ 5 phút; 37oC/ 60 phút; 72oC/ 10 phút; Giữ ở 4oC 4 DTT (0,1M) 2 -
5 First strand buffer (5x) 4 -
6 M-MLV (200U/µL) 1 -
3.5.5. Phƣơng pháp realtime RT-PCR định lƣợng virus
Nghiên cứu này lựa chọn phương pháp realtime RT-PCR định lượng tương đối (2-ΔΔCT
method) (Rao et al., 2013)để so sánh lượng virus bài thải ra ngoài qua các thời điểm, giữa lợn được gây nhiễm bởi virus cường độc và virus nhược độc.
Cặp mồi đặc hiệu và chu trình nhiệt được dùng theo nghiên cứu đã công bố: định lượng TGEV (Ma et al., 2014), định lượng PEDV (Miller et al., 2016).
Phản ứng realtime PCR được thực hiện bởi máy ABI StepOne (hình 3.1). Do sử dụng phản ứng SYBR Green realtime PCR, sau khi thực hiện phản ứng, tiến hành phân tích melting curve để xác định độ đặc hiệu của phản ứng (hình 3.2). Nếu chỉ thấy đỉnh tính hiệu ở nhiệt độ biến tính của sản phẩm được nhân lên, chứng tỏ phản ứng là đặc hiệu.
Hình 3.1. Ví dụ về kết quả phản ứng SYBR Green realtime PCR
3.5.6. Phƣơng pháp giải trình tự gen mã hóa spike protein (gen S)
Trong quá trình tiếp đờiin vitro, nhiều gen của PEDV và TGEV có xảy ra
đột biến ở gen mã hóa protein cấu trúc và protein phi cấu trúc (Won et al., 2019;
Wu et al., 2019; Lee et al., 2017, Bernard and Laude, 1995). Trong đó gen mã
hóa protein S có biến đổi nhiều nhất và là một trong những gen liên quan tới đặc
tính nhược độc của virus (Lee et al., 2017; Hou and Wang, 2019). Do vậy, trong
khuôn khổ nghiên cứu này, gen S của TGEV và PEDV ở các lần tiếp đời khác nhau đã được giải mã. Trình tự primer đặc hiệu được trình bày ở bảng 3.2 và bảng 3.3.
Bảng 3. 2. Trình tự primer đặc hiệu giải trình tự gen S của PEDV
Đoạn
gen Tên mồi Trình tự (5’ - 3’) Nhiệt
độ (o C) Kích thƣớc (bp) P1 S5F TCTTCTGGCGTAATTCCACA 56,9 1216 S1220R TGAGCCTTCAGCAAGAATGA 57,1 P2 S621F GGCCCCACTGCTAATAATGA 57,3 1399 S2019R TGGTACAGGCACTAGCCAAA 58,9 P3 S1441F TCAATGGGTTTGGATACTTGC 56,5 1391 S2831R TCCATCACCATTAAACGAACT 55,2 P4 S2219 F TTCTAGCTTTTTGGCAGGTG 56,2 1409 S3627R CATCACCACCACAAAAACCA 56,7 P5 DPS3045F GGTGTTGTTGACGCTGAGAA 58,7 1377 DP4421R TGACAACTGTGTCAATCGTGT 58,1
Trình tự mồi (bảng 3.2) được lựa chọn theo công bố trước đây (Barrera et
al., 2017). Trong đó đoạn gen S của PEDV sẽ được nhân lên bởi 5 phân đoạn khác nhau (P1- P5), mỗi phân đoạn có khoảng 500 nucleotide gối nhau ở mỗi đầu để đảm bảo thu được trình tự gen đúng ở 2 đầu của mỗi phân đoạn.
Đối với TGEV, trình tự gen S hoàn chỉnh được nhân lên bởi 5 phân đoạn với 10 cặp mồi được thiết kế trong nghiên cứu này (bảng 3.3). Các cặp mồi được thiết kế dựa trên cơ sở phân tích 22 trình tự gen S của TGEV (không trình bày).
Bảng 3. 3. Trình tự primer đặc hiệu giải trình tự gen S của TGEV
Đoạn
gen Tên mồi Trình tự (5’ - 3’) độ (Nhiệt o
C) Kích thƣớc (bp) T1 1F 20265 AATTGAATGAAATGGTCATTGG 58,0 1180 1R 21444 TGAAAACACTGTGGCACCCTT 58,0 T2 2F 21289 CCTAGCTTTGAAGAAGCAGCT 58,0 1327 2R 22615 CTATGGTACCATCAATAACAGC 58,0 T3 3F 22439 ATGGTAGAACTGGTGTTGGTA 58,0 1159 3R 23597 GACTGTGTAATGTTACCAATAGC 58,0 T4 4F 23439 AACATTAGGTGCACTTGGTGG 58,0 1107 4R 24545 CACACATACCAAGGCCATTTTA 58,0 T5 5F 24233 TGCTGTTTGTTAATGCAACTGT 58,0 603 5R 24835 TGGATTTGACAATGTCCATACA 58,0
Phản ứng PCR nhân gen được thực hiện với kít thương mại2X PCR Master
mix solution (i-MAXⅡ, 25266, iNtRON Biotechnology). Phân tích sản phẩm
PCR bằng điện di trong thạch agarose 2% có bổ sung thuốc nhuộm ADN (RedSafe) 1x.
3.5.7. Phƣơng pháp phân tích trình tự gen
Sản phẩm PCR nhân gen S của PEDV và TGEV được giải mã bởi công ty Macrogen (Hàn Quốc). Trình tự gen S được bắt cặp so sánh với các trình tự tương ứng của PEDV, TGEV được công bố trên Genbank. Phần mềm BioEdit (phiên bản 7.2.6.1) (Hall, 1999) được dùng để sắp xếp- căn chỉnh trình tự nucleotide của các chủng PEDV, TGEV. Cây phát sinh chủng loại (phylogenetic tree) được xây dựng bằng thuật toán neighbor-joining, tích hợp trong chương trình MEGA phiên bản 7.0.26(Kumar et al., 2016). Ngoài ra, so sánh trình tự nucleotide và trình tự acid amin suy diễn của haichủng virus PEDV, TGEV với trình tự công bố trên ngân hàng gen quốc tế, sẽ phân tích được sự biến đổi di truyền tại các vị trí quan trọng của protein S.
3.5.8. Phƣơng pháp xử lý số liệu
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. ĐẶC TÍNH ỔN ĐỊNH HIỆU GIÁ CỦA CHỦNG GIỐNG PEDV, TGEV
Một trong những đặc tính quan trọng của chủng giống vacxin là tính ổn định về hiệu giá và ổn định về đặc điểm bệnh tích tế bào. Chuẩn độ chủng giống PEDV và TGEV trên môi trường tế bào Vero và ST để xác định đặc tính ổn định hiệu giá của giống. Kết quả được trình bày ở hình 4.1 và hình 4.2.
Hình 4. 1. Bệnh tích tế bào gây nhiễm bởi PEDV và TGEV
Ghi chú: tế bào Vero nhiễm PEDV (A) hình thành thể hợp bào gồm hàng trăm nhân (giới hạn bởi đường nét đứt); tế bào ST nhiễm TGEV (C) hình thành những cụm gồm nhiều tế bào co tròn, bong khỏi bề mặt chai nuôi (mũi
Kết quả trình bày ở hình 4.1 cho biết PEDV và TGEV hình thành bệnh tích tế bào trong quá trình nhân lên. Trong đó PEDV có bệnh tích đặc hiệu là thể hợp bào với đám lớn nhân tế bào. Đặc điểm này là ổn định qua các lần tiếp đời, xuất hiện tương đối sớm sau gây nhiễm 12- 24 giờ. Đối với TGEV, trên môi trường tế bào ST không hình thành thể hợp bào mà chỉ hình thành những đám tế bào co tròn, nổi trên thảm tế bào. Hình 4.2 trình bày kết quả xác định hiệu giá của giống virus ở một số lần tiếp đời.
Hình 4. 2. Hiệu giá chủng PEDV và TGEV ở các lần tiếp đời
Ghi chú: hiệu giá (log10 TCID50) của virus được xác định ở các đời gần với đời được chọn làm giống vacxin (đánh dấu màu xám)
Có thể thấy hiệu giá của PEDV dao động trong khoảng từ 7,1 đến 7,5 log10
TCID50/ ml. Trong khi đó chủng giống TGEV có hiệu giá cao hơn, dao động từ
8,5 đến 8,7 log10 TCID50/ ml. Chúng tôi nhận thấy có sự biến động nhẹ về hiệu
giá giứa các lần tiếp đời, nhưng sự dao động này không vượt quá 1 log10
TCID50/ml. Do đó, các chủng giống được xác định có đặc tính ổn định hiệu giá.
4.2. ĐẶC ĐIỂM NHƢỢC ĐỘC HÓA CỦA CHỦNG VIRUS PEDV, TGEV
Các coronavirus gây tiêu chảy phổ biến ở lợn (PEDV, TGEV) có thể nhân lên ở lợn mọi lứa tuổi, trong đó lợn con giai đoạn theo mẹ là mẫn cảm
nhất(Gerber et al., 2016), với tỷ lệ chết có thể lên tới 100%. Trong khuôn khổ nghiên cứu này, chúng tôi chứng minh đặc tính nhược độc hóa của 2 chủng PEDV và TGEV ở lợn sơ sinh, chưa được bú sữa đầu. Các chỉ tiêu chính được
theo dõi sau gây nhiễm nhằm chứng minh tính nhược độc bao gồm: (i) bệnh tích
đại thể và vi thể, (ii) hàm lượng virus thải qua phân theo thời gian và (iii) sự phân bố và hàm lượng virus nhân lên ở các đoạn khác nhau của đường tiêu hóa.
4.2.1. Triệu chứng lâm sàng của lợn gây nhiễm
Lợn sau gây nhiễm được cho uống sữa bằng syringe riêng rẽ và nuôi cách biệt nhau. Tiến hành theo dõi các biểu hiện như nôn mửa, tình trạng tiêu chảy và độ ướt của giấy lót ổ. Kết quả theo dõi được trình bày ở hình 4.3.
Hình 4. 3. Triệu chứng của lợn nhiễm virus cƣờng độc và nhƣợc độc
Ghi chú: lợn gây nhiễm virus cường độc (A, C) bị tiêu chảy làm ướt giấy lót (vùng giới hạn bởi hình tròn); lợn gây nhiễm virus nhược độc (B, D) có hậu môn khô, giấy lót ổ khô ráo (vùng giới hạn bởi hình vuông)
Thấy rõ sự tương phản giữa lợn được gây nhiễm chủng virus cường độc (hình 4.3 A, C) có hiện tượng tiêu chảy nhiều nước, lợn run rẩy và ủ rũ. Ngược lại, lợn ở nhóm gây nhiễm virus nhược độc có hậu môn khô, giấy lót ổ không bị ướt trong quá trình theo dõi. Trong 72 giờ theo dõi, không có lợn chết ở nhóm gây nhiễm bởi các chủng cường độc và nhược độc. Tổng hợp triệu chứng được trình bày ở bảng 4.1.
Bảng 4.1. Tổng hợp triệu chứng của lợn nhiễm virus cƣờng độc/ nhƣợc độc
Nhóm độc lực
Virus (đời cấy chuyển)
Số con có triệu chứng/ số con gây nhiễm
Nôn mửa Phân tanh Phân nhiều nƣớc Phân bết hậu môn Cường độc PEDV (P10) 1/3 3/3 3/3 3/3 TGEV (P10) 0/3 3/3 3/3 3/3 Tổng hợp gây nhiễm chủng cƣờng độc 1/6 6/6 6/6 6/6 Nhược độc PEDV (P100) 0/3 0/3 0/3 0/3 TGEV (P130) 0/3 1/3 0/3 0/3 Tổng hợp gây nhiễm chủng nhƣợc độc 0/6 1/6 0/6 0/6
Ghi chú: chủng PEDV và TGEV cường độc là chủng ở lần tiếp đời thứ 10 (P10). Chủng nhược độc là chủng dùng sản xuất vacxin, ở lần tiếp đời thứ 100 (P100) và 130 (P130) đối với PEDV và TGEV. Các chủng giống virus (nhược độc, cường độc) dùng trong nghiên cứu này được cung cấp bởi công ty AVAC.
Kết quả theo dõi triệu chứng của các lợn gây nhiễm bởi virus cường độc cho thấy triệu chứng tiêu chảy nhiều nước, phân có mùi tanh, gây đặc biệt là chủ yếu, gặp ở 6/6 lợn. 0/6 lợn của nhóm gây nhiễm bởi chủng nhược độc không có các biểu hiện như trên. Ngoài ra, triệu chứng nôn mửa rất ít gặp (1/6) lợn gây nhiễm chủng virus cường độc. Các đặc điểm về triệu chứng ở lợn con theo mẹ nhiễm PEDV kể trên cũng được mô tả ở nhiều nghiên cứu trong và ngoài
nước(Nguyễn Văn Điệp và cs., 2014; Sun et al., 2012).
Mặc dù lợn ở mọi lứa tuổi đều cảm nhiễm PEDV nhưng lợn con theo mẹ là nhóm có biểu hiện bệnh rõ nhất. Tính độc của PEDV đã được chứng minh với
lợn sơ sinh (Thomas et al., 2015): ở liều thấp (10 ml huyễn dịch virus có hiệu giá
trong khoảng 560- 0,056 TCID50/ml) cũng gây ra triệu chứng, bệnh tích. Do đó,
nghiên cứu này đã chọn đúng đối tượng để kiểm tra độc tính của chủng giống virus nhược độc. Tuy nhiên, cũng nên mở rộng thí nghiệm kiểm tra độc lực ở lợn giai đoạn nuôi thịt, lợn hậu bị.
4.2.2. Biến đổi bệnh lý đại thể của lợn gây nhiễm
Để tiếp tục làm rõ đặc điểm nhược độc hóa của chủng giống, chúng tôi đã mổ khám và so sánh biến đổi bệnh lý đại thể, vi thể của 2 nhóm lợn. Các kết quả được trình bày ở bảng 4.2.Biến đổi bệnh lý đại thể được minh họa ở hình 4.4.
Bảng 4.2. Tổng hợp bệnh tích của lợn nhiễm virus cƣờng độc/ nhƣợc độc
Nhóm bệnh tích
Nhóm virus cƣờng độc
Nhóm virus nhƣợc độc
PEDV TGEV PEDV TGEV
Sữa chưa tiêu Dạ dày 3/3 3/3 3/3 3/3 Ruột 3/3 3/3 0/3 0/3 Ruột non Mỏng, trong 3/3 3/3 0/3 0/3 Giãn, nhiều dịch 3/3 3/3 0/3 0/3