Phần 4 Kết quả và thảo luận
4.2. Đặc điểm nhược độc hóa của chủng virus PEDV,TGEV
4.2.3. Biến đổi bệnh lý vi thể ở ruột non của lợn gâynhiễm
Tiến hành quan sát tiêu bản bệnh lý vi thể là đoạn ruột non để xác định có/ không có hiện tượng teo lông nhung (đặc trưng cho bệnh do PEDV, TGEV gây ra), kết quả được minh họa ở hình 4.5.
Hình 4. 5. Bệnh tích vi thể của lợn gây nhiễm bằng PEDV
Ghi chú: tiêu bản không tràng được nhuộm HE. Lợn nhiễm virus PED cường độc có chiều dài lông nhung ruột (mũi tên nét liền) ngắn hơn so với chiều dài lông nhung lợn nhiễm virus PED nhược độc. Trong khi
đó, chiều sâu của tuyến ruột (mũi tên nét đứt) là giống nhau giữa nhóm nhiễm virus cường độc và virus nhược độc.
Kết quả ở hình 4.5 cho biết ở lợn gây nhiễm bởi nhóm cường độc có biểu hiện teo lông nhung, với chiều dài của lông nhung giảm đi so với chiều sâu của tuyến ruột. Ngược lại, lông nhung ruột non của nhóm lợn nhiễm chủng virus nhược độc không có hiện tượng này. Thêm vào đó, lợn nhiễm PEDV cường độc, quan sát rõ hiện tượng thâm nhiễm tế bào bạch cầu ở lông nhung ruột (hình 4.5). Hiện tượng lông nhung ruột bị phá hủy, dẫn tới giảm tỷ lệ giữa chiều cao lông nhung và chiều sâu của tuyến tiêu hóa là một trong những biến đổi bệnh lý vi thể
điển hình của nhóm virus gây tiêu chảy (Madson et al., 2016, Boonsoongnern et
Hình 4.6 minh họa bệnh tích vi thể ở ruột non của nhóm lợn được gây nhiễm bởi chủng TGEV cường độc và nhược độc.
Hình 4. 6. Bệnh tích vi thể của lợn gây nhiễm bằng TGEV
Ghi chú: tiêu bản không tràng được nhuộm HE. Lợn nhiễm virus TGEV cường độc có chiều dài lông nhung ruột (mũi tên nét liền) ngắn hơn so với chiều dài lông nhung lợn nhiễm virus TGEV nhược
độc.Chiều sâu của tuyến ruột được biểu thị bởi mũi tên nét đứt.
Nhóm lợn gây nhiễm bởi chủng TGEV cường độc có hiện tượng teo lông nhung ruột một cách rõ ràng so (hình 4.6 A) so với nhóm gây nhiễm bởi chủng nhược độc (hình 4.6 B). Có thể thấy mức độ phá hủy lông nhung ruột của chủng TGEV cường độc và nhược độc là khác biệt. Kết quả này cho thấy chủng TGEV dùng chế vacxin phá hủy hạn chế tế bào lông nhung ruột và nhược độc.
4.2.4. Kết quả nghiên cứu sự bài thải và phân bố virus ở đƣờng tiêu hóa
Nghiên cứu này tiếp tục so sánh lượng virus thải ra và lượng virus nhân lên ở các đoạn khác nhau của đường tiêu hóa để chứng minh tính nhược độc của chủng giống PEDV và TGEV. Kết quả trình bày ở hình 4.7.
Hình 4. 7. Sự bài thải và phân bố của virus trong đƣờng tiêu hóa
Ghi chú: phương pháp realtime RT-PCR định lượng tương đối được dùng để so sánh sự chênh lệch về lượng virus bài thải, cũng như lượng virus nhân lên ở các đoạn khác nhau của đường tiêu hóa. Trục Oy
biểu diễn số lần khác nhau về lượng virus giữa các mẫu được so sánh so với mẫu được dùng làm mẫu hiệu chuẩn đánh dấu bởi mũi tên (được quy về giá trị 1, đường nét đứt màu đen). Chiều cao của cột biểu
thị số lần khác biệt của một mẫu so với mẫu hiệu chuẩn. Các mẫu có sự khác biệt rõ giữa nhóm virus cường độc và nhược độc được đánh dấu màu xanh.
Về sự bài thải virus sau gây nhiễm, lợn được gây nhiễm bởi chủng PEDV hoặc TGEV cường độc có hiện tượng thải virus qua phân phát hiện được sau gây nhiễm 24 giờ. Lượng virus thải ra sau đó tăng lên, và gấp ~3 lần tại thời điểm 72 giờ so với thời điểm 24 giờ sau nhiễm. Ở chiều ngược lại, tại thời điểm 24 giờ sau nhiễm, phản ứng realtime-RT/PCR chưa phát hiện được virus thải qua phân ở nhóm nhiễm bởi chủng virus nhược độc. Nhóm lợn này bắt đầu thải virus qua
phân từ thời điểm 48 giờ sau nhiễm. Độ trễ về thời gian và lượng virus thải ra của chủng PEDV nhược độc được xác định trong nghiên cứu này cũng đã được biết đến đối với một số chủng virus PEDV nhược độc khác, ví dụ như chủng PEDV PT-P96 của Đài Loan (Chang et al., 2017). So sánh về lượng, dễ nhận thấy PEDV và TGEV thải qua phân ở nhóm lợn nhiễm virus nhược độc luôn thấp hơn so với nhóm lợn nhiễm virus cường độc (hình 4.7 A, C).
Nghiên cứu gây nhiễm PEDV cho lợn nái cho biết lợn bắt đầu thải virus (phát hiện bằng phương pháp RT-PCR) sau gây nhiễm 96 giờ và kéo dài 9-10 ngày. Ở chiều ngược lại, một số nghiên cứu trên thế giới đã rút ra nhận xét rằng lợn có ngày tuổi càng nhỏ khi nhiễm virus sẽ thải virus càng sớm và kéo dài (Leidenberger et al., 2017). Ở chiều ngược lại, lợn con theo mẹ nhiễm virus sẽ thải virus sớm hơn (sau nhiễm 1 ngày) và thời gian thải virus kéo dài hơn (20
ngày sau nhiễm) (Leidenberger et al., 2017). Xét ở khía cạnh thời gian bài thải,
kết quả của nghiên cứu này là phù hợp khi đều phát hiện được PEDV và TGEV cường độc thải qua phân sau nhiễm 24 giờ. Thời điểm nhóm lợn nhiễm virus nhược độc thải virus muộn hơn là một bằng chứng về sự nhân lên hạn chế về số lượng và mức độ của nhóm virus này.
Về vị trí nhân lên của PEDV trên đường tiêu hóa của lợn, nghiên cứu này phát hiện virus cường độc và nhược độc đều nhân lên ở hầu hết các đoạn ruột (hình 4.7 B). Đặc điểm này của chủng PEDV dùng trong nghiên cứu này là giống với chủng PEDV BJ2011C, CHM2013-SPBJ và CHM2013-SP khi chúng đều nhân lên ởcác đoạn khác nhau của đường tiêu hóa của lợn con (Wang et al.,
2018). Mặc dù vậy, một số chủng PEDV ví dụ như Pingtung 52 của Đài Loan (Peng et al., 2018) chỉ giới hạn vị trí nhân lên ở đoạn không tràng và hồi tràng mà không nhân lên ở tá tràng và manh tràng. Sự khác biệt nêu trên phản ánh sự khác biệt về độc lực và đặc tính sinh học của chủng virus. Tuy nhiên, trong phạm vi nghiên cứu này, chúng tôi không có điều kiện để tìm hiểu về vấn đề này.Không tràng là đoạn ruột trong đó các chủng PEDV đều nhân lên. Kết quả nghiên cứu trình bày ở hình 4.7 B cho biết chủng PEDV cường độc nhân lên ở không tràng nhiều gấp xấp xỉ 7 lần so với chủng PEDV nhược độc. Như vậy, đối với chủng PEDV nhược độc, có thể nhận thấy có sự giới hạn về lượng virus nhân lên ở sự nhân lên ở ruột non. Đặc điểm này cũng đã được biết đến với nhiều chủng PEDV nhược độc trên thế giới (Wu et al., 2019, Li et al., 2017).
Về vị trí nhân lên của TGEV trên đường tiêu hóa của lợn, một số tác giả đã phát hiện rằng virus có độc lực khác nhau thì có xu hướng nhân lên ở toàn bộ đoạn ruột hay giới hạn ở đoạn hồi tràng (Kim and Chae, 2002a, Cubero et al.,
1992). Kết quả thu được trong nghiên cứu này (hình 4.7 D) cho biết, mặc dù không có sự giới hạn về vị trí nhân lên ở các đoạn ruột non, nhưng có sự khác biệt rõ về hàm lượng virus giữa chủng TGEV độc lực và chủng nhược độc. Cụ thể, chủng TGEV độc lực nhân lên với lượng gấp hàng chục lần chủng TGEV nhược độc ở các đoạn ruột non. Sự nhân lên hạn chế của TGEV nhược độc ở các đoạn ruột (hình 4.7 D) là tương quan với lượng virus thải ra qua phân rất thấp của lợn nhiễm virus nhược độc này (hình 4.7 C).
4.3. ĐẶC ĐIỂM ỔN ĐỊNH DI TRUYỀN CỦA CHỦNG GIỐNG
Ở phạm vi của nghiên cứu này, đặc điểm ổn định di truyền của chủng giống chỉ được phân tích đối với gen mã hóa protein S của virus. Dưới đây là kết quả phân tích trình tự gen của PEDV và TGEV qua các lần tiếp đời.
Hình 4. 8. Giản đồ giải trình tự gen S của PEDV và TGEV
Phân tích giản đồ giải trình tự (chromatogram) của sản phẩm PCR, có thể thấy ở mỗi vị trí nucleotide đều có đỉnh tín hiệu rõ ràng. Kết quả này cho biết các trình tự nucleotide thu được là chính xác và đáng tin cậy.
4.3.1. Đặc điểm ổn định di truyền của chủng PEDV
Dựa vào trình tự gen thu được, chúng tôi đã xây dựng được cây phát sinh chủng loại của chủng PEDV làm giống vacxin với các chủng tham chiếu khác.
Hình 4. 9. Cây phát sinh chủng loại của PEDV dựa vào trình tự gen S
Kết quả ở hình 4.9 cho thấy chủng giống AVAC/VR/PED.98 thuộc genogroup 2 và dưới nhóm G2.1. Đây là genogroup lưu hành phổ biến hiện nay trên thế giới và ở Việt Nam. Cây phát sinh chủng loại cũng cho thấy phần lớn các chủng PEDV lưu hành ở Việt Nam thuộc genogroup G2 và chiếm một tỷ lệ nhỏ là các chủng thuộc genogroup G1. Đặc điểm này cho phép nhận xét về khả năng bảo hộ của chủng giống vacxin với genogroup đang lưu hành phổ biến ở Việt Nam.
Đặc điểm ổn định di truyền gen S của chủng giống PEDV dùng cho sản xuất vacxin (đời 100, P100) được làm rõ trên cơ sở so sánh mức tương đồng trình tự nucleotide và amino acid với các chủng ở lần tiếp đời thấp hơn (P37) và đời cao hơn (P120- P150).
Bảng 4.3. Mức độ tƣơng đồng nucleotide gen S của PEDV
P37 P100 P120 P130 P140 P100 0,999 P120 0,999 1 P130 0,999 1 1 P140 0,998 0,999 0,999 0,999 P150 0,998 0,999 0,999 0,999 1
Kết quả phân tích cho biết trình tự nucleotide gen S của PEDV nhược độc (đời 100 trở đi) có sai khác so với chủng PEDV còn độc lực (đời 37), với mức tương đồng 0,998 - 0,999. Các chủng PEDV từ lần tiếp đời 100 đến 130 giống nhau hoàn toàn về trình tự nucleotide của gen S (mức tương đồng là 1). Tuy nhiên, từ đời 140 đến đời 150, đã xuất hiện đột biến nucleotide dẫn tới mức tương đồng so chủng giống (đời 100) chỉ còn 0,999 (vùng đóng khung, bảng 4.3). Chúng tôi tiếp tục phân tích trình tự amino acid suy diễn để làm rõ hơn bản chất của sự thay đổi nucleotide giữa các đời (bảng 4.4).
Bảng 4.4. Mức độ tƣơng đồng amino acid protein S của PEDV
P37 P100 P120 P130 P140 P100 0,997 P120 0,997 1 P130 0,997 1 1 P140 0,996 0,998 0,998 0,998 P150 0,996 0,998 0,998 0,998 1
Mức tương đồng trình tự amino acid ở các lần tiếp đời là thấp hơn so với mức tương đồng trình tự nucleotide. Điều này phản ánh sự biến đổi nucleotide dẫn tới thay đổi amino acid được mã hóa. Kết quả phân tích trên toàn chiều dài gen S đã xác định được 3 vị trí đột biến và được trình bày ở bảng 4.5.
Bảng 4.5. Sự thay đổi trình tự nucleotide và amino acid của PEDV
Lần tiếp đời
Vị trí nucleotide/ amino acid
79-80-81/ /27 232-233-234/ /78 583-584-585/ /195
P37 TCA S ATC I TAC Y
P100 TCA S GTC V TGC C
P120 TCA S GTC V TGC C
P130 TCA S GTC V TGC C
P140 GCA A GTC V TGC C
P150 GCA A GTC V TGC C
Đã có sự biến đổi trình tự nucleotide và amino acid được mã hóa ở gen S trong quá trình nhược độc hóa PEDV: vị trí amino acid 78 và 195. Hai thay đổi này là bảo thủ giữa các chủng PEDV nhược độc. Khi tiếp tục tiếp đời (đời P140 đến P150), xuất hiện đột biến nucleotide ở vị trí codon thứ 1 của bộ ba mã hóa, dẫn tới thay đổi từ Serine (S) sang Alanine (A) ở vị trí amino acid 27. Tuy nhiên, trình tự tiểu phần S1 hoàn toàn bảo thủ (không trình bày). Từ các kết quả trình bày ở bảng 4.3 đến bảng 4.5 cho thấy: chủng giống PEDV ổn định di truyền trong vòng 30 lần tiếp đời kể từ đời P100. Giống sẽ bị biến đổi nếu tiếp tục truyền đời.
4.3.2. Đặc điểm ổn định di truyền của chủng TGEV
Cây phát sinh chủng loại của chủng giống TGEV được trình bày ở hình 4.10.Kết quả phân loại ở hình 4.10 cho biết chủng giống AVAC/VR/TGE.15 thuộc nhóm cổ điển và không nằm cùng phân nhánh với các chủng virus TGEV nhược độc trên thế giới, ví dụ như Miller M60, Purdue P115 (mũi tên rỗng, hình 4.10). Chủng AVAC/VR/TGE.15 cũng nằm xa với virus thuộc nhóm PRCV.
Đặc điểm ổn định di truyền gen S của chủng giống TGEV dùng cho sản xuất vacxin (đời 130, P130) được làm rõ trên cơ sở so sánh mức tương đồng trình tự nucleotide và amino acid với các chủng ở lần tiếp đời thấp hơn (P5, P100, P120) và đời cao hơn (P140, P150).
Hình 4. 10. Cây phát sinh chủng loại của TGEV dựa vào trình tự gen S
Ghi chú: chủng giống TGEV vacxin (lần tiếp đời 130) được chỉ bằng mũi tên đầy màu đen. Các chủng virus tiếp đời xung quanh đời 130 được đánh dấu màu xanh nhạt.
Bảng 4.6. Mức độ tƣơng đồng nucleotide gen S của TGEV Lần tiếp đời P5 P100 P120 P130 P140 P100 0,997 P120 0,997 0,999 P130 0,997 0,999 1 P140 0,997 0,999 1 1 P150 0,997 0,999 1 1 1
Kết quả phân tích cho biết trình tự nucleotide gen S của TGEV nhược độc (đời 120 trở đi) có sai khác so với chủng TGEV còn độc lực (P5), với mức tương đồng 0,997. Các chủng TGEV từ lần tiếp đời 130 đến 150 giống nhau hoàn toàn về trình tự nucleotide của gen S (mức tương đồng là 1). Từ đời 100, đã xuất hiện đột biến nucleotide dẫn tới mức tương đồng so chủng giống (đời 130) chỉ còn 0,999 (vùng đóng khung, bảng 4.6). Chúng tôi tiếp tục phân tích trình tự amino acid suy diễn để làm rõ hơn bản chất của sự thay đổi nucleotide giữa các đời (bảng 4.7).
Bảng 4.7. Mức độ tƣơng đồng amino acid protein S của TGEV
Lần tiếp đời P5 P100 P120 P130 P140 P100 0,995 P120 0,994 0,999 P130 0,994 0,999 1 P140 0,994 0,999 1 1 P150 0,994 0,999 1 1 1
Mức tương đồng trình tự amino acid ở lần tiếp đời P100 so với các lần tiếp đời sau P120-P150 giống với mức tương đồng dựa vào trình tự nucleotide (bảng 4.6), chứng tỏ đột biến nucleotide là đột biến câm (silent mutation). Đáng lưu ý,
cácn lần tiếp đời từ P120 đến P150, không thấy đột biến nucleotide cũng như amino acid của TGEV. Kết quả phân tích trên toàn chiều dài gen S đã xác định được 8 vị trí đột biến và được trình bày ở bảng 4.8.
Bảng 4.8. Sự thay đổi trình tự nucleotide và amino acid của TGEV
Vị trí nu/ aa Lần tiếp đời P5 P100 P120 P130 P140 P150 64-66/ TTT > TCT TCT TCT TCT TCT /22 F > S S S S S 289-291/ TGG > TCG TCG TCG TCG TCG /97 W > S S S S S
622-624/ TTT TTT > ATT ATT ATT ATT
/208 F F > I I I I
1267-1269/ ACT > AGT AGT AGT AGT AGT
/423 T > S S S S S
1303-1305/ TTA > TTC TTC TTC TTC TTC
/435 L > F F F F F
1321-1323/ ATG > ATT ATT ATT ATT ATT
/441 M > I I I I I
1366-1368/ GTC > TTC TTC TTC TTC TTC
/446 V > F F F F F
1504-1506/ TGT > TTT TTT TTT TTT TTT
/502 C > F F F F F
Ghi chú: dấu “>“ biểu thị sự biến đổi nucleotide và amino acid ở 1 vị trí giữa các lần tiếp đời
Khác với chủng giống PEDV, từ chủng giống đời P130, nếu tiếp tục tiếp đời đến đời P150 không dẫn tới đột biến làm thay đổi trình tự amino acid được mã hóa. Nói cách khác, chủng giống TGEV ổn định di truyền trong vòng 20 lần tiếp đời kể từ đời P130.
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
5.1. KẾT LUẬN
Về đặc tính ổn định hiệu giá:
Giống virus AVAC/VR/PED.98và AVAC/VR/TGE.15 có đặc tính ổn định
hiệu giá, với mức dao động từ 7,1 đến 7,5 log10 TCID50/ ml (PEDV) và 8,5 đến
8,7 log10 TCID50/ ml (TGEV).
Về đặc tính nhƣợc độc:
- Chủng giống AVAC/VR/PED.98 và AVAC/VR/TGE.15 không gây
bệnh cho lợn thậm chí ở giai đoạn mẫn cảm nhất.
- So với chủng virus cường độc, cả 2 chủng virus nhược độc nhân lên một cách hạn chế ở đường tiêu hóa và thời gian bài thải qua phân chậm hơn.
Về đặc tính ổn định di truyền:
Trong vòng 20 lần tiếp đời, chủng giống virus AVAC/VR/PED.98 và AVAC/VR/TGE.15 có tính ổn định trình tự gen quyết định kháng nguyên chính.
5.2. KIẾN NGHỊ
Tiếp tục nghiên cứu đặc tính của chủng giống AVAC/VR/PED.98 (P100)
và AVAC/VR/TGE.15 (P130) ở các khía cạnh: (i) đặc tính nhược độc ở lợn nái
và lợn thịt; (ii) đặc tính sinh miễn dịch và khả năng bảo hộ chéo với các chủng
TÀI LIỆU THAM KHẢO
I. Tài liệu tiếng Việt:
1. Huỳnh Minh Trí, Nguyễn Hoàng Việt và Nguyễn Ngọc Hải, (2017). Khảo sát tỷ
lệ nhiễm virus gây bệnh tiêu chảy cấp (porcine epidemic diarhea virus - PEDV) trên heo nái và xác định các yếu tố nguy cơ liên quan đến bệnh PED tại tỉnh Tiền Giang. Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ. 52. tr. 1-7.
2. Lê Văn Phan, Nguyễn Trung Tiến, Vũ Thị Thu Hằng, Huỳnh Thị Mỹ Lệ và Nguyễn
Bá Hiên, (2015). Một số đặc điểm sinh học phân tử của virus gây ra dịch tiêu chảy