Ghi chú: hiệu giá (log10 TCID50) của virus được xác định ở các đời gần với đời được chọn làm giống vacxin (đánh dấu màu xám)
Có thể thấy hiệu giá của PEDV dao động trong khoảng từ 7,1 đến 7,5 log10
TCID50/ ml. Trong khi đó chủng giống TGEV có hiệu giá cao hơn, dao động từ
8,5 đến 8,7 log10 TCID50/ ml. Chúng tôi nhận thấy có sự biến động nhẹ về hiệu
giá giứa các lần tiếp đời, nhưng sự dao động này không vượt quá 1 log10
TCID50/ml. Do đó, các chủng giống được xác định có đặc tính ổn định hiệu giá.
4.2. ĐẶC ĐIỂM NHƢỢC ĐỘC HÓA CỦA CHỦNG VIRUS PEDV, TGEV
Các coronavirus gây tiêu chảy phổ biến ở lợn (PEDV, TGEV) có thể nhân lên ở lợn mọi lứa tuổi, trong đó lợn con giai đoạn theo mẹ là mẫn cảm
nhất(Gerber et al., 2016), với tỷ lệ chết có thể lên tới 100%. Trong khuôn khổ nghiên cứu này, chúng tôi chứng minh đặc tính nhược độc hóa của 2 chủng PEDV và TGEV ở lợn sơ sinh, chưa được bú sữa đầu. Các chỉ tiêu chính được
theo dõi sau gây nhiễm nhằm chứng minh tính nhược độc bao gồm: (i) bệnh tích
đại thể và vi thể, (ii) hàm lượng virus thải qua phân theo thời gian và (iii) sự phân bố và hàm lượng virus nhân lên ở các đoạn khác nhau của đường tiêu hóa.
4.2.1. Triệu chứng lâm sàng của lợn gây nhiễm
Lợn sau gây nhiễm được cho uống sữa bằng syringe riêng rẽ và nuôi cách biệt nhau. Tiến hành theo dõi các biểu hiện như nôn mửa, tình trạng tiêu chảy và độ ướt của giấy lót ổ. Kết quả theo dõi được trình bày ở hình 4.3.
Hình 4. 3. Triệu chứng của lợn nhiễm virus cƣờng độc và nhƣợc độc
Ghi chú: lợn gây nhiễm virus cường độc (A, C) bị tiêu chảy làm ướt giấy lót (vùng giới hạn bởi hình tròn); lợn gây nhiễm virus nhược độc (B, D) có hậu môn khô, giấy lót ổ khô ráo (vùng giới hạn bởi hình vuông)
Thấy rõ sự tương phản giữa lợn được gây nhiễm chủng virus cường độc (hình 4.3 A, C) có hiện tượng tiêu chảy nhiều nước, lợn run rẩy và ủ rũ. Ngược lại, lợn ở nhóm gây nhiễm virus nhược độc có hậu môn khô, giấy lót ổ không bị ướt trong quá trình theo dõi. Trong 72 giờ theo dõi, không có lợn chết ở nhóm gây nhiễm bởi các chủng cường độc và nhược độc. Tổng hợp triệu chứng được trình bày ở bảng 4.1.
Bảng 4.1. Tổng hợp triệu chứng của lợn nhiễm virus cƣờng độc/ nhƣợc độc
Nhóm độc lực
Virus (đời cấy chuyển)
Số con có triệu chứng/ số con gây nhiễm
Nôn mửa Phân tanh Phân nhiều nƣớc Phân bết hậu môn Cường độc PEDV (P10) 1/3 3/3 3/3 3/3 TGEV (P10) 0/3 3/3 3/3 3/3 Tổng hợp gây nhiễm chủng cƣờng độc 1/6 6/6 6/6 6/6 Nhược độc PEDV (P100) 0/3 0/3 0/3 0/3 TGEV (P130) 0/3 1/3 0/3 0/3 Tổng hợp gây nhiễm chủng nhƣợc độc 0/6 1/6 0/6 0/6
Ghi chú: chủng PEDV và TGEV cường độc là chủng ở lần tiếp đời thứ 10 (P10). Chủng nhược độc là chủng dùng sản xuất vacxin, ở lần tiếp đời thứ 100 (P100) và 130 (P130) đối với PEDV và TGEV. Các chủng giống virus (nhược độc, cường độc) dùng trong nghiên cứu này được cung cấp bởi công ty AVAC.
Kết quả theo dõi triệu chứng của các lợn gây nhiễm bởi virus cường độc cho thấy triệu chứng tiêu chảy nhiều nước, phân có mùi tanh, gây đặc biệt là chủ yếu, gặp ở 6/6 lợn. 0/6 lợn của nhóm gây nhiễm bởi chủng nhược độc không có các biểu hiện như trên. Ngoài ra, triệu chứng nôn mửa rất ít gặp (1/6) lợn gây nhiễm chủng virus cường độc. Các đặc điểm về triệu chứng ở lợn con theo mẹ nhiễm PEDV kể trên cũng được mô tả ở nhiều nghiên cứu trong và ngoài
nước(Nguyễn Văn Điệp và cs., 2014; Sun et al., 2012).
Mặc dù lợn ở mọi lứa tuổi đều cảm nhiễm PEDV nhưng lợn con theo mẹ là nhóm có biểu hiện bệnh rõ nhất. Tính độc của PEDV đã được chứng minh với
lợn sơ sinh (Thomas et al., 2015): ở liều thấp (10 ml huyễn dịch virus có hiệu giá
trong khoảng 560- 0,056 TCID50/ml) cũng gây ra triệu chứng, bệnh tích. Do đó,
nghiên cứu này đã chọn đúng đối tượng để kiểm tra độc tính của chủng giống virus nhược độc. Tuy nhiên, cũng nên mở rộng thí nghiệm kiểm tra độc lực ở lợn giai đoạn nuôi thịt, lợn hậu bị.
4.2.2. Biến đổi bệnh lý đại thể của lợn gây nhiễm
Để tiếp tục làm rõ đặc điểm nhược độc hóa của chủng giống, chúng tôi đã mổ khám và so sánh biến đổi bệnh lý đại thể, vi thể của 2 nhóm lợn. Các kết quả được trình bày ở bảng 4.2.Biến đổi bệnh lý đại thể được minh họa ở hình 4.4.
Bảng 4.2. Tổng hợp bệnh tích của lợn nhiễm virus cƣờng độc/ nhƣợc độc
Nhóm bệnh tích
Nhóm virus cƣờng độc
Nhóm virus nhƣợc độc
PEDV TGEV PEDV TGEV
Sữa chưa tiêu Dạ dày 3/3 3/3 3/3 3/3 Ruột 3/3 3/3 0/3 0/3 Ruột non Mỏng, trong 3/3 3/3 0/3 0/3 Giãn, nhiều dịch 3/3 3/3 0/3 0/3 Xung huyết/ xuất huyết 0/3 0/3 0/3 0/3 Hạch màng treo ruột xung huyết Ruột non 0/3 0/3 0/3 0/3 Ruột già 0/3 0/3 0/3 0/3
Ghi chú: toàn bộ lợn mổ khám tại thời điểm dừng thí nghiệm (72 giờ) là còn sống. Biến đổi bệnh tích đại thể được quan sát và chụp ảnh ngay tại thời điểm mổ khám.
Hình 4. 4. Bệnh tích đại thể của lợn gây nhiễm virus
Ghi chú: lợn nhiễm virus cường độc (A, C, E, G) có thành ruột non mỏng, trong (vòng tròn) và thấy rõ cục sữa (mũi tên); lợn nhiễm virus nhược độc (B, D, F, H) ruột non co nhỏ và săn lại (hình vuông).
Ở tất cả các lợn mổ khám, nghiên cứu này không ghi nhận được biến đổi bệnh lý đại thể ở các hệ cơ quan ngoài đường tiêu hóa như: hô hấp, tuần hoàn. Ở nhóm gây nhiễm bởi các chủng PEDV và TGEV cường độc, nhóm bệnh tích quan sát được ở hệ tiêu hóa chủ yếu tập trung vào các đặc điểm giảm tiêu hóa/ giảm hấp thu. Hiện tượng ruột non có màu trong, chứa nhiều dịch xuất hiện ở 100% số lợn gây nhiễm bởi chủng PEDV và TGEV cường độc.Nhiều thí nghiệm gây bệnh thực nghiệm trên thế giới cho thấy đặc điểm bệnh lý cơ bản của lợn mắc PED là thành ruột non mỏng, trong, bên trong lòng ruột có nhiều dịch màu vàng và cục sữa không tiêu (Sueyoshi et al., 1995b; Shi et al., 2017). Ở góc độ này, kết quả gây bệnh thực nghiệm với chủng độc lực cao là phù hợp. Ngược lại, ở nhóm gây nhiễm bởi các chủng giống virus vacxin, khi mổ khám thấy nhu động ruột non rất mạnh, ruột non co lại và săn lại. Lòng ruột non của nhóm lợn này không chứa nhiều dịch. Nhóm bệnh tích khác biệt rõ rệt nhất giữa lợn nhiễm virus cường độc và virus nhược độc là ở ruột non và được đánh dấu màu xám ở bảng 4.2.
So sánh giữa nhóm cường độc và nhóm nhược độc: 100% số lợn mổ khám đều quan sát được sữa đông vón trong dạ dày. Khác với nhiều nghiên cứu khác, cục sữa đông vón trong dạ dày thường được nhấn mạnh như một bệnh tích điển hình của lợn mắc PED(Nguyễn Văn Điệp và cs., 2014). Cục sữa đông trong dạ dày là do lợn con chết mà không kịp tiêu hóa hết, nên chúng tôi cho rằng đây không phải là bệnh tích điển hình của bệnh.
Với các kết quả thu được từ việc so sánh triệu chứng, bệnh tích đại thể có thể thấy 2 chủng giống vacxin PEDV và TGEV không gây ra các biểu hiện đặc trưng của bệnh tiêu chảy cấp. Biến đổi bệnh lý nhẹ ở đường tiêu hóa của nhóm lợn gây nhiễm bởi chủng giống vacxin (PEDV và TGEV) phù hợp với các quan sát về triệu chứng lâm sàng nhẹ ở nhóm lợn này trong thời gian theo dõi (trình bày ở bảng 4.1).
4.2.3. Biến đổi bệnh lý vi thể ở ruột non của lợn gây nhiễm
Tiến hành quan sát tiêu bản bệnh lý vi thể là đoạn ruột non để xác định có/ không có hiện tượng teo lông nhung (đặc trưng cho bệnh do PEDV, TGEV gây ra), kết quả được minh họa ở hình 4.5.
Hình 4. 5. Bệnh tích vi thể của lợn gây nhiễm bằng PEDV
Ghi chú: tiêu bản không tràng được nhuộm HE. Lợn nhiễm virus PED cường độc có chiều dài lông nhung ruột (mũi tên nét liền) ngắn hơn so với chiều dài lông nhung lợn nhiễm virus PED nhược độc. Trong khi
đó, chiều sâu của tuyến ruột (mũi tên nét đứt) là giống nhau giữa nhóm nhiễm virus cường độc và virus nhược độc.
Kết quả ở hình 4.5 cho biết ở lợn gây nhiễm bởi nhóm cường độc có biểu hiện teo lông nhung, với chiều dài của lông nhung giảm đi so với chiều sâu của tuyến ruột. Ngược lại, lông nhung ruột non của nhóm lợn nhiễm chủng virus nhược độc không có hiện tượng này. Thêm vào đó, lợn nhiễm PEDV cường độc, quan sát rõ hiện tượng thâm nhiễm tế bào bạch cầu ở lông nhung ruột (hình 4.5). Hiện tượng lông nhung ruột bị phá hủy, dẫn tới giảm tỷ lệ giữa chiều cao lông nhung và chiều sâu của tuyến tiêu hóa là một trong những biến đổi bệnh lý vi thể
điển hình của nhóm virus gây tiêu chảy (Madson et al., 2016, Boonsoongnern et
Hình 4.6 minh họa bệnh tích vi thể ở ruột non của nhóm lợn được gây nhiễm bởi chủng TGEV cường độc và nhược độc.
Hình 4. 6. Bệnh tích vi thể của lợn gây nhiễm bằng TGEV
Ghi chú: tiêu bản không tràng được nhuộm HE. Lợn nhiễm virus TGEV cường độc có chiều dài lông nhung ruột (mũi tên nét liền) ngắn hơn so với chiều dài lông nhung lợn nhiễm virus TGEV nhược
độc.Chiều sâu của tuyến ruột được biểu thị bởi mũi tên nét đứt.
Nhóm lợn gây nhiễm bởi chủng TGEV cường độc có hiện tượng teo lông nhung ruột một cách rõ ràng so (hình 4.6 A) so với nhóm gây nhiễm bởi chủng nhược độc (hình 4.6 B). Có thể thấy mức độ phá hủy lông nhung ruột của chủng TGEV cường độc và nhược độc là khác biệt. Kết quả này cho thấy chủng TGEV dùng chế vacxin phá hủy hạn chế tế bào lông nhung ruột và nhược độc.
4.2.4. Kết quả nghiên cứu sự bài thải và phân bố virus ở đƣờng tiêu hóa
Nghiên cứu này tiếp tục so sánh lượng virus thải ra và lượng virus nhân lên ở các đoạn khác nhau của đường tiêu hóa để chứng minh tính nhược độc của chủng giống PEDV và TGEV. Kết quả trình bày ở hình 4.7.
Hình 4. 7. Sự bài thải và phân bố của virus trong đƣờng tiêu hóa
Ghi chú: phương pháp realtime RT-PCR định lượng tương đối được dùng để so sánh sự chênh lệch về lượng virus bài thải, cũng như lượng virus nhân lên ở các đoạn khác nhau của đường tiêu hóa. Trục Oy
biểu diễn số lần khác nhau về lượng virus giữa các mẫu được so sánh so với mẫu được dùng làm mẫu hiệu chuẩn đánh dấu bởi mũi tên (được quy về giá trị 1, đường nét đứt màu đen). Chiều cao của cột biểu
thị số lần khác biệt của một mẫu so với mẫu hiệu chuẩn. Các mẫu có sự khác biệt rõ giữa nhóm virus cường độc và nhược độc được đánh dấu màu xanh.
Về sự bài thải virus sau gây nhiễm, lợn được gây nhiễm bởi chủng PEDV hoặc TGEV cường độc có hiện tượng thải virus qua phân phát hiện được sau gây nhiễm 24 giờ. Lượng virus thải ra sau đó tăng lên, và gấp ~3 lần tại thời điểm 72 giờ so với thời điểm 24 giờ sau nhiễm. Ở chiều ngược lại, tại thời điểm 24 giờ sau nhiễm, phản ứng realtime-RT/PCR chưa phát hiện được virus thải qua phân ở nhóm nhiễm bởi chủng virus nhược độc. Nhóm lợn này bắt đầu thải virus qua
phân từ thời điểm 48 giờ sau nhiễm. Độ trễ về thời gian và lượng virus thải ra của chủng PEDV nhược độc được xác định trong nghiên cứu này cũng đã được biết đến đối với một số chủng virus PEDV nhược độc khác, ví dụ như chủng PEDV PT-P96 của Đài Loan (Chang et al., 2017). So sánh về lượng, dễ nhận thấy PEDV và TGEV thải qua phân ở nhóm lợn nhiễm virus nhược độc luôn thấp hơn so với nhóm lợn nhiễm virus cường độc (hình 4.7 A, C).
Nghiên cứu gây nhiễm PEDV cho lợn nái cho biết lợn bắt đầu thải virus (phát hiện bằng phương pháp RT-PCR) sau gây nhiễm 96 giờ và kéo dài 9-10 ngày. Ở chiều ngược lại, một số nghiên cứu trên thế giới đã rút ra nhận xét rằng lợn có ngày tuổi càng nhỏ khi nhiễm virus sẽ thải virus càng sớm và kéo dài (Leidenberger et al., 2017). Ở chiều ngược lại, lợn con theo mẹ nhiễm virus sẽ thải virus sớm hơn (sau nhiễm 1 ngày) và thời gian thải virus kéo dài hơn (20
ngày sau nhiễm) (Leidenberger et al., 2017). Xét ở khía cạnh thời gian bài thải,
kết quả của nghiên cứu này là phù hợp khi đều phát hiện được PEDV và TGEV cường độc thải qua phân sau nhiễm 24 giờ. Thời điểm nhóm lợn nhiễm virus nhược độc thải virus muộn hơn là một bằng chứng về sự nhân lên hạn chế về số lượng và mức độ của nhóm virus này.
Về vị trí nhân lên của PEDV trên đường tiêu hóa của lợn, nghiên cứu này phát hiện virus cường độc và nhược độc đều nhân lên ở hầu hết các đoạn ruột (hình 4.7 B). Đặc điểm này của chủng PEDV dùng trong nghiên cứu này là giống với chủng PEDV BJ2011C, CHM2013-SPBJ và CHM2013-SP khi chúng đều nhân lên ởcác đoạn khác nhau của đường tiêu hóa của lợn con (Wang et al.,
2018). Mặc dù vậy, một số chủng PEDV ví dụ như Pingtung 52 của Đài Loan (Peng et al., 2018) chỉ giới hạn vị trí nhân lên ở đoạn không tràng và hồi tràng mà không nhân lên ở tá tràng và manh tràng. Sự khác biệt nêu trên phản ánh sự khác biệt về độc lực và đặc tính sinh học của chủng virus. Tuy nhiên, trong phạm vi nghiên cứu này, chúng tôi không có điều kiện để tìm hiểu về vấn đề này.Không tràng là đoạn ruột trong đó các chủng PEDV đều nhân lên. Kết quả nghiên cứu trình bày ở hình 4.7 B cho biết chủng PEDV cường độc nhân lên ở không tràng nhiều gấp xấp xỉ 7 lần so với chủng PEDV nhược độc. Như vậy, đối với chủng PEDV nhược độc, có thể nhận thấy có sự giới hạn về lượng virus nhân lên ở sự nhân lên ở ruột non. Đặc điểm này cũng đã được biết đến với nhiều chủng PEDV nhược độc trên thế giới (Wu et al., 2019, Li et al., 2017).
Về vị trí nhân lên của TGEV trên đường tiêu hóa của lợn, một số tác giả đã phát hiện rằng virus có độc lực khác nhau thì có xu hướng nhân lên ở toàn bộ đoạn ruột hay giới hạn ở đoạn hồi tràng (Kim and Chae, 2002a, Cubero et al.,
1992). Kết quả thu được trong nghiên cứu này (hình 4.7 D) cho biết, mặc dù không có sự giới hạn về vị trí nhân lên ở các đoạn ruột non, nhưng có sự khác biệt rõ về hàm lượng virus giữa chủng TGEV độc lực và chủng nhược độc. Cụ thể, chủng TGEV độc lực nhân lên với lượng gấp hàng chục lần chủng TGEV nhược độc ở các đoạn ruột non. Sự nhân lên hạn chế của TGEV nhược độc ở các đoạn ruột (hình 4.7 D) là tương quan với lượng virus thải ra qua phân rất thấp của lợn nhiễm virus nhược độc này (hình 4.7 C).
4.3. ĐẶC ĐIỂM ỔN ĐỊNH DI TRUYỀN CỦA CHỦNG GIỐNG
Ở phạm vi của nghiên cứu này, đặc điểm ổn định di truyền của chủng giống chỉ được phân tích đối với gen mã hóa protein S của virus. Dưới đây là kết quả phân tích trình tự gen của PEDV và TGEV qua các lần tiếp đời.
Hình 4. 8. Giản đồ giải trình tự gen S của PEDV và TGEV
Phân tích giản đồ giải trình tự (chromatogram) của sản phẩm PCR, có thể thấy ở mỗi vị trí nucleotide đều có đỉnh tín hiệu rõ ràng. Kết quả này cho biết các trình tự nucleotide thu được là chính xác và đáng tin cậy.
4.3.1. Đặc điểm ổn định di truyền của chủng PEDV
Dựa vào trình tự gen thu được, chúng tôi đã xây dựng được cây phát sinh chủng loại của chủng PEDV làm giống vacxin với các chủng tham chiếu khác.
Hình 4. 9. Cây phát sinh chủng loại của PEDV dựa vào trình tự gen S
Kết quả ở hình 4.9 cho thấy chủng giống AVAC/VR/PED.98 thuộc genogroup 2 và dưới nhóm G2.1. Đây là genogroup lưu hành phổ biến hiện nay trên thế giới và ở Việt Nam. Cây phát sinh chủng loại cũng cho thấy phần lớn các chủng PEDV lưu hành ở Việt Nam thuộc genogroup G2 và chiếm một tỷ lệ nhỏ là các chủng thuộc genogroup G1. Đặc điểm này cho phép nhận xét về khả năng bảo hộ của chủng giống vacxin với genogroup đang lưu hành phổ biến ở Việt Nam.
Đặc điểm ổn định di truyền gen S của chủng giống PEDV dùng cho sản xuất vacxin (đời 100, P100) được làm rõ trên cơ sở so sánh mức tương đồng trình