2.3.1. Miễn dịch chống PEDV, TGEV
Lợn con sinh ra chưa có kháng thể, chúng có được kháng thể (chủ yếu là IgG) thông qua việc bú sữa mẹ. Điều này khiến lợn con sơ sinh rất dễ bị nhiễm rất nhiều bệnh truyền nhiễm khác nhau. Ở lợn nái, IgG là có nhiều trong sữa non và được truyền từ huyết thanh lợn nái. Những globulin miễn dịch này được vận chuyển qua biểu mô ruột của lợn con chỉ trong vòng 24-48h đầu sau khi sinh. Trong 2-3 ngày tiếp theo, trong quá trình chuyển đổi sang sữa, IgA trở nên chiếm ưu thế và tồn tại trong sữa trong suốt thời kỳ cho con bú.
Lợn con sinh ra từ lợn mẹ đã có miễn dịch sẽ được bảo vệ khỏi PEDV, TGEV nhờ kháng thể IgG truyền qua sữa đầu tuy nhiên độ dài miễn dịch phụ thuộc vào hiệu giá kháng thể của lợn mẹ cũng như lượng kháng thể lợn con hấp thu được nhiều hay ít từ sữa mẹ. Sau khi lợn mẹ cảm nhiễm với kháng nguyên PEDV,TGEV các tế bào sinh miễn dịch IgA di chuyển tới tuyến vú và chế tiết kháng thể IgA vào sữa đầu. Lợn con bú sữa từ lợn mẹ đã có miễn dịch sẽ được bổ sung liên tục vào đường tiêu hoá của nó một lượng kháng thể IgA. Lượng IgG chiếm hơn 60% lượng Immunoglobulin trong sữa đầu. IgA có tác dụng ngăn cản sự tấn công của virus theo đường niêm mạc, chúng bám trên niêm mạc tế bào lông nhung ruột non hiệu quả trong việc trung hoà mầm bệnh lây nhiễm qua đường miệng hơn là IgG hay IgM do nó bền vững hơn trước sự phân huỷ protein trong đường ruột và có khả năng trung hoà virus cao hơn IgG và IgM. Vì thế việc truyền IgA thụ động từ những con mẹ có miễn dịch sẽ gây ra khả năng miễn dịch tốt ở lợn con trong giai đoạn bú mẹ.
Năm 2001, Shibata nghiên cứu khả năngmiễn dịch của sữa đầu (Shibata et
al., 2001). Sử dụng sữa đầu của bò cái đã được tiêm chủng và không tiêm chủng
những lợn con được uống sữa đầu có miễn dịch có tỷ lệ sống sót cao thậm chí 100% ở hiệu giá kháng thể 1:512, ngược lại là 0% đối với những lợn con được uống sữa đầu không có miễn dịch. Mổ khám bệnh tích cũng cho thấy kết quả bệnh trầm trọng hơn ở những lợn con uống sữa đầu không có miễn dịch: teo lông nhung ruột, virus PED hiện diện ở không tràng và hồi tràng sau 24 giờ gây nhiễm. Kết quả cho thấy sữa đầu có miễn dịch bảo vệ lợn con chống lại virus PED lúc mới sinh(Shibata et al., 2001).
Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch của lợn con khi được gây nhiễm chủng TGEV nhược độc, kết quả cho thấy, sau 7 ngày gây nhiễm lượng kháng thể sản sinh ra rất thấp. Tiêm nhắc lại ở ngày thứ 7 sau khi tiêm mũi thứ nhất cho thấy hiệu giá kháng thể tăng rất ít, tuy nhiên huyết thanh có hiệu giá cao khi tiêm nhắc lại vào ngày thứ 15. Ngoài ra nghiên cứu còn cho thấy, tại thời điểm đầu sau khi gây nhiếm virus glubolin miễn dịch chủ yếu là IgM trong khi đó càng về sau kháng thể sinh ra chủ yếu là IgG. Bằng phản ứng trung hòa không thấy phản ứng chéo giữa 10 chủng TGEV (8 chủng phân lập ở Mỹ, 1 chủng phân lập ở Anh và 1 chủng ở Nhật Bản)(Kemeny, 1976).
Năm 1975 (Bohl and Saif, 1975) đã tiến hành thí nghiệm gây nhiễm TGEV cho lợn nái chửa bằng các đường đưa kháng nguyên khác nhau sau đó định lượng hàm lượng kháng thể đồng thời xác định các nhóm globulin miễn dịch được sản sinh ra sau khi gây nhiễm. Kết quả cho thấy nếu kháng nguyên được đưa theo đường uống và đường tiêm kháng thể trong sữa chủ yếu là IgG (lượng IgA rất thấp), khi công cường độc bằng các chủng có độc lực cao thì tỷ lệ chết của lợn con là 25%. Sử dụng các chủng có độc lực tiêm bắp cho lợn nái, lợn có biểu hiện bệnh TGE, kháng thể trong sữa chủ yếu là IgA, lợn con sinh ra từ lợn nái này được bảo hộ với tỷ lệ chết là 0%. Với đường tiêm nội bì bằng các chủng virus cường độc, không thấy lợn nái nào có biểu hiện bệnh và kháng thể sinh ra chủ yếu là IgG với hiệu giá kháng thể cao.
2.3.2. Vacxin phòng bệnh PEDV, TGEV
Hiện nay có 3 dòng vacxin được sử du ̣ng trong viê ̣c phòng chống tiêu chảy trên lơ ̣n do virus TGE và PED gây ra, đó là vacxin vô hoa ̣t, auto vacxin và vacxin nhươ ̣c đô ̣c. Vacxin vô hoa ̣t có hiê ̣u quả thấp, trong khi auto vacxin thường được sử du ̣ng ở các công ty lớn, đem la ̣i hiê ̣u quả cao , tuy nhiên thường chỉ được sử
dụng nội bộ . Ruột heo 3 – 5 ngày tuổi, còn sống có biểu hiện lâm sàng được sử dụng làm Autovacxin, liều lượng ăn 10ml/ngày và cho ăn liên tục 3 – 5 ngày. Các đối tượng được cho ăn bao gồm nái chờ phối, mang thai từ tuần 1 đến tuần 16 và nái chờ đẻ. Nái có biểu hiện lâm sàng không cho ăn đối với nái đẻ có lợn con biểu hiện lâm sàng không cho ăn. Khi cho ăn đảm bảo đủ vòng, kín đàn à tránh tái lại lần sau. Đánh giá hiệu quả Autovacxin là khoảng 30% nái ăn huyễn dịch ruột PED có triệu chứng lâm sàng như bỏ ăn, tiêu chảy là hiệu quả.
Một số vacxin phòng bệnh PED chế từ các chủng virus có trình tự gen, độc lực, cách thức phân bố khác nhau vẫn được tiếp tục nghiên cứu và hoàn thiện. Virus dòng CV777 đã thích ứng trên với môi trường tế bào có trình tự gen khác biệt rõ rệt so với chủng CV777 phân lập từ thực địa, sự khác biệt này liên quan tới việc suy giảm mạnh độc lực của virus cũng như việc giảm nhẹ mức độ thay đổi mô bệnh học ở lợn mắc bệnh.
Năm 1997, ở Nhật Bản , chủng virus PED 83P-5 (G1-a) được làm nhược đô ̣c sau 100 đời cấy chuyển trên tế bào Vero sau đó được phát triển thành vắc -xin nhươ ̣c đô ̣c da ̣ng tiêm (P-5 V) tại Nhật bản và Hàn Quốc . Mặc dù những vacxin này được xem là khá hiệu quả, tuy nhiên không phải tất cả lợn nái sử dụng vacxin đều tạo được miễn dịch qua sữa ổnđịnh.
Năm 2010 (Wang et al., 2010) đã tiến hành nghiên cứu xác định mối quan
hệ về nguồn gốc phát sinh giữa một chủng PEDV thực địa ởTrung Quốc (CH/GSJIII/07) và hai chủng virus vacxin. Kết quả cho thấy, các chủng PEDV của Trung Quốc (không bao gồm CH/GSJIII/07) có mối quan hệ phát sinh gen gần gũi với các chủng Hàn Quốc và khác biệt về mặt di truyền với các chủng vacxin PEDV. Tuy nhiên, chủng CH/GSJIII/07 có mối quan hệ phát sinh gen gần gũi với hai chủng vacxin, điều đó cho thấy rằng nó có thể đã tiến hóa từ một chủng vacxin sống và vacxin sống có thể tiến triển thành những dạng có khả năng truyềnlây cao hơn khi được sử dụng trên thực địa.
Hiệu quả thấp đến trung bình của vacxin PEDV hiện tại có thể là do sự khác biệt về kháng nguyên, di truyền (> 10% axit amin giữa các protein S tương ứng) và sự khác biệt về phylogenetic (G1 so với G2) giữa các chủng vacxin và các chủng ngoài thực địa (Kim et al., 2015); (Lee et al., 2015); (Oh et al., 2014).Nghiên cứu của (Lee, 2015) đã chỉ ra rằng những con lợn nái phơi nhiễm
trước đây với PEDV thuộc genotype G1 có khả năng miễn dịch bảo vệ chéo cho con lợn chống lại công cường độc bằng chủng virus cường độc genotype G2b.
Tại Hàn Quốc, loại vacxin phòng bệnh PED chế từ chủng DR13 P100 nhược độc đã được nghiên cứu và đưa vào sản xuất. Virus vacxin có độ ổn định và an toàn cao, virus vacxin đem cấy chuyển 3 đời trên lợn thu được vẫn duy trì được độ an toàn khi tiêm phòng cho lợn. Năm 2011, tại Philippin, vacxin này được đăng ký và thương mại hoá. Mặc dù các loại vacxin thương mại này được coi là có hiệu quả và đã được sử dụng rộng rãi, nhưng không phải tất cả các động vật đều có khả năng sản sinh miến dịch tốt. Một số yếu tố được cho là có liên quan đến khả năng sản sinh miễn dịch của vacxin thương mại, bao gồm cả loại vacxin và đường tiêm chủng của vacxin (Lee, 2015). (Song et al., 2007) đã chứng minh nái mang thai uống virus dòng DR13, lợn con sinh ra tỷ lệ tử vong ở lợn con do PED giảm xuống. Mặc dù nhiều lợi ích của vacxin DR13 đã được chứng minh, tuy nhiên không có sự khác biệt nhiều về thời gian bài thải virus trên lợn con thử nghiệm, đây là một chỉ số quan trọng về mức độ bảo hộ miễn dịchđồng thời DR13 cũng không làm giảm mức độ nghiêm trọng của bệnh tiêu chảy.Hiệu giá kháng thể trong huyết thanh cao hơn sẽ làm cho thời gian bài thải virus ngắn hơn, giảm mức độ trầm trọng và thời gian tiêu chảy ở lợn con, việc bảo hộ hoàn toàn khỏi sự lây nhiễm PEDV giúp phòng chống lại sự bài thải virus khi lợn tiếp xúc với virus cường độc. Khi cho lợn con uống PEDV nhược độc, miễn dịch tạo được chỉ phần nào bảo vệ chúng trước thử thách từ các chủng cường độc. Ở liều uống thấp, chỉ có 25% lợn được bảo vệ khi gây nhiễm và tỷ lệ này tăng lên 50% khi lợn được uống với liều tăng lên gấp 20 lần(De Arriba et al., 2002). Do đó các yếu tố như hạn chế sự bài thải virus ở lợn con, đáp ứng miễn dịch niêmmạc với PEDV cần được chú trọng.
Hầu hết các vac xin TGEV trên thi ̣ trường hiê ̣n nay là v acxin nhược đô ̣c , đươ ̣c tiêm cho lợn nái trong thời kỳ mang thai . Điều này s ẽ giúp cho lợn con có đươ ̣c kháng thể phòng bê ̣nh qua đường sữa me ̣ . Các v acxin trên thị trường thường là vacxin nhi ̣ giá hoă ̣c tam giá kết hợp với phòng bê ̣nh do virus rota , PED hoă ̣c vi khuẩn Escherichia coli. Các vac xin thế hệ mớ i đang thử nghiê ̣m như vacxin DNA, vacxin tái tổ hơ ̣p và vector v acxin. Ví dụ , Adenovirus trên lơ ̣n thường được sử du ̣ng như mô ̣t hê ̣ biểu hiê ̣n protein gai của virus TGE (Tuboly
and Nagy, 2001). Các plasmid DNA chứa vật chất di truyền của virus PED và TGE đươ ̣c ta ̣o ra để phát triển vacxin DNA nhi ̣ giá(Huang et al., 2013).
Một loại vacxin dựa trên gen TGEV N được biểu thị trong một vec tơ
Salmonella typhimurium. Lợn con dưới 20 ngày tuổi được gây nhiễm bằng cách
cho uống 1 × 10 12 CFU Salmonella typhimurium SL7207 (pVAX-N). Kết quả
thấy SL7207 có thể tạo ra đáng kể kháng thể-IgG, kháng thể-IgA, interleukin-4 và-interferon, đạt tối đa vào tuần thứ 6 (Zhang et al., 2016).
Nghiên cứu cho thấy việc áp dụng IgY có thể làm giảm đáng kể tỷ lệ tử vong của lợn con. Gây nhiễm cho 15 lợn con 3 ngày tuổi và không có kháng thể của mẹ chống lại TGEV đã được chọn để tiến hành thí nghiệm. Có 8 lợn được cho uống 3 ml IgY (64 NT) ba lần một ngày trước khi gây nhiễm virus, lợn con của nhóm này được uống với IgY hằng ngày, 7 lợn còn lại sử dụng làm đối chứng. Tất cả lợn con đều được gây nhiễm TGEV bằng miệng với liều 5 LD50/ml. Triệu chứng lâm sàng và tỷ lệ tử vong của lợn con đã được quan sát trong hai tuần sau đó. Kết quả cho thấy tất cả lợn con đã phát hiện ra các dấu hiệu lâm sàng của bệnh tiêu chảy vàng trong vòng hai ngày sau gây nhiễm. Hai đến bốn ngày sau, triệu chứng mất nước xuất hiện. Tỷ lệ tử vong của nhóm đối chứng > 50% trong vòng một tuần, trong khi nhóm được điều trị IgY là 12,5% (Zuo et al., 2009).
PHẦN 3. NỘI DUNG - NGUYÊN LIỆU - PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
- Phòng nghiên cứu và phát triển sản phẩm vacxin, Công ty TNHHMTV AVAC Việt Nam, thôn Ngọc Lịch – xã Trưng Trắc – huyện Văn Lâm – tỉnh Hưng Yên.
- Phòng thí nghiệm bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm, Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
3.2. THỜI GIAN THỰC HIỆN ĐỀ TÀI
Từ ngày 01 tháng 10 năm 2018 đến ngày 30 tháng 09 năm 2019.
3.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
3.3.1. Đánh giá đặc tính ổn định hiệu giá của PEDV và TGEV 3.3.2. Đánh giá tính nhƣợc độc lực của 2 chủng PEDV và TGEV 3.3.2. Đánh giá tính nhƣợc độc lực của 2 chủng PEDV và TGEV
- Triệu chứng, bệnh tích ở lợn sơ sinh. - Hàm lượng virus thải qua phân.
- Sự phân bố và hàm lượng virus ở đường tiêu hóa.
3.3.3. Đánh giá đặc tính ổn định di truyền của hai chủng PEDV và TGEV
- Giải trình tự gen S của chủng PEDV và TGEV ở các lần tiếp đời xung quanh đời chọn làm vacxin: PEDV (P37, P100, P120, P130, P140 và P150); TGEV (P5, P100, P120, P130, P140 và P150).
- Phân tích trình tự gen S của hai chủng PEDV P100 và TGEV P130. So sánh với trình tự gen tương ứng của các chủng virus vacxin/ cường độc lưu hành trên thế giới.
3.4. ĐỐI TƢỢNG - VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 3.4.1. Đối tƣợng nghiên cứu
- Giống virus TGEV P130, PEDV P100.
3.4.2. Vật liệu nghiên cứu
- Môi trường tế bào Vero và ST (công ty AVAC cung cấp)
- Động vật thí nghiệm: lợn sơ sinh chưa bú sữa đầu; âm tính TGEV, PEDV - Trình tự mồi đặc hiện phát hiện và giải trình tự gen của PEDV, TGEV - Hóa chất tách ARN (TRIzol) và kít tổng hợp cDNA (MMLV)
- Bộ kít PCR (2X PCR Master mix solution, i-MAXⅡ)
- Kit SYBR Green PCR
- Trình tự gen mã hóa protein bề mặt (gen S)
3.5. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.5.1. Phƣơng pháp xác định hiệu giá virus
Hiệu giá của PEDV và TGEV được xác định bằng cách pha loãng virus tới hạn theo cơ số 10 (từ 10-1
đến 10-10) sau đó gây nhiễm lên đĩa 96 giếng có thảm
tế bào Vero (đối với PEDV) và tế bào ST (đối với TGEV). Các bước được tóm tắt như sau:
- Trước khi gây nhiễm, thảm tế bào được rửa 2 lần bằng PBS 1X
-Nhỏ mẫu đã pha loãng vào giếng của đĩa tế bào (100 µl/giếng). Mỗi nồng độ gây nhiễm vào một dãy 3 giếng
- Ủ đĩa ở 37oC trong vòng 1 giờ, sau đó loại bỏ huyễn dịch virus
- Bổ sung môi trường duy trì với thành phần: DMEM + 0,05% yeast extract + 0,3% tryptose phosphate broth + 10 µg/ml trypsin. Môi trường duy trì cho nuôi cấy TGEV có thành phần tương tự với lượng trypsin giảm còn 3µg/ml.
- Đĩa chuẩn độ nuôi trong tủ ấm 37oC, 5% CO2. Hàng ngày theo dõi kết quả bệnh tích tế bào và kết thúc thí nghiệm tại thời điểm 96h sau gây nhiễm. Kết quả được tính theo công thức Spearman-Karber.
Trong đó: L là logarit của độ pha loãng cao nhất có 100% có số giếng huỷ hoại. D là sự chênh lệch log giữa các độ pha loãng mẫu. S là tổng số giếng huỷ hoại ở các độ pha loãng không có 100% số giếng huỷ hoại. N là số giếng gây nhiễm cho mỗi độ pha loãng.
3.5.2. Phƣơng pháp kiểm tra tính nhƣợc độc hóa của virus
Tính độc của PEDV đã được chứng minh với lợn sơ sinh (Thomas et al.,
2015): ở liều thấp (10 ml huyễn dịch virus có hiệu giá trong khoảng 560- 0,056
TCID50/ml) cũng gây ra triệu chứng, bệnh tích. Do đó, nghiên cứu này đã chọn
liều virus của lọ vacxin (105,0 TCID50/ml) để thử độc lực của chủng virus vacxin
ở lợn sơ sinh. Hơn nữa, trong điều kiện Việt Nam, rất khó tìm được trang trại âm tính kháng thể PEDV, do đó, nghiên cứu này chọn lợn sơ sinh (chưa bú sữa đầu) để tiến hành nghiên cứu, thay vì lợn > 5-10 ngày tuổi như một số nghiên cứu (Gerber et al., 2016).
Trước khi gây nhiễm, lợn sơ sinh được điều trị dự phòng nhiễm khuẩn kế phát sử dụng bằng kháng sinh (Baytril 5%) với liều khuyến cáo. Toàn bộ lợn sơ sinh dùng trong nghiên cứu này đã được sàng lọc âm tính với PEDV và TGEV bằng phương pháp RT-PCR. Sau gây nhiễm, quan sát thể trạng của lợn, tình trạng tiêu chảy trong vòng 72 giờ. Tiến hành lấy dịch swab ở hậu môn sau mỗi 12 giờ để nghiên cứu sự bài thải virus.
Tại thời điểm 72 giờ sau nhiễm, toàn bộ lợn được mổ khám theo phương pháp thường quy của Bộ môn Vi sinh vật- Truyền nhiễm. Tiến hành chụp ảnh