Chủng vi khuẩn Tổng số chủng Số chủng đƣợc xét nghiệm cho kết quả dƣơng tính
femA gltA phoA oprL md h Staphylococcus aureus 5 5 − − − − Acinetobacter baumannii 5 − 5 − − − Escherichia coli 5 − − 5 − − Pseudomonas aeruginosa 5 − − − 5 − Klebsiella pneumoniae 5 − − − − 5 Streptococcus suis 5 _ _ _ _ _ Tổng số 30 5 5 5 5 5
Kết quả thu được ở bảng 1 cho thấy 25 chủng chứa gen đích gồm
Staphylococcus aureus (n=5), Acinetobacter baumannii (n=5), Escherichia
coli (n=5), Pseudomonas aeruginosa (n=5), Klebsiella pneumoniae (n=5) cho
kết quả dương tính, chủng vi khuẩn còn lại Streptococcus suis (n=5) cho kết
quả âm tính. Điều này chứng tỏ phản ứng multiplex PCR đã tối ưu có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, có khả năng khuếch đại chính xác gen đích trong chủng vi khuẩn quan tâm. Trong trường hợp này, kĩ thuật multiplex PCR chứng tỏ được độ nhạy và độ đặc hiệu là 100% trong việc phát hiện đúng các chủng vi khuẩn. Dự đoán giá trị âm tính và dương tính của kĩ thật multiplex PCR là 100%.
3.5. Kết quả thử nghiệm phƣơng pháp multiplex PCR trên mẫu bệnh phẩm
3.5.1. Kết quả thử nghiệm phƣơng pháp multiplex PCR trên các mẫu bệnh phẩm cấy máu
Nhằm mục tiêu đưa phương pháp multiplex PCR áp dụng vào thực tiễn để chẩn đoán và phát hiện nhanh nhiễm khuẩn huyết, chúng tôi thử nghiệm phương này trên mẫu bệnh phẩm cấy máu trước. Phương pháp multiplex PCR được thử nghiệm trên 68 mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân nghi ngờ nhiễm khuẩn huyết nhận được từ bệnh viện Thanh Nhàn. Các mẫu này đã được mã hóa để tăng tính khách quan cho thử nghiệm.
Đầu tiên, DNA của các chủng vi khuẩn từ 68 mẫu bệnh phẩm cấy máu được tách chiết bằng phương pháp đun sôi (theo mô tả phần vật liệu và phương pháp nghiên cứu). Tiếp theo, chúng tôi dùng DNA đã tách chiết được để làm khuôn cho phản ứng multiplex PCR. Kết quả multiplex PCR được điện di triểm tra trên gel agarose 1% và so sánh với kết quả cấy máu.
Hình 3.8. Thử nghiệm phƣơng pháp multiplex PCR trên mẫu bệnh phẩm cấy máu.
Hình ảnh điện di sản phẩm multiplex PCR trên một số mẫu bệnh phẩm cấy máu. 1. Đối chứng âm, 2. Marker 1kb, 3-17. Sản phẩm multiplex PCR của các mẫu BN1-BN15.
Kết quả điện di kiểm tra trên gel agarose cho thấy sản phẩm PCR của các mẫu bệnh phẩm BN2 (đường chạy 4), BN4 (đường chạy 6), BN8 (đường chạy 10), BN10 (đường chạy 12), BN12 (đường chạy 14) cho kết quả dương tính với các băng sáng rõ tương ứng với kích thước của các gen đích gltA
(722 bp) của chủng Acinetobacter baumannii, mdh (364 bp) của chủng Klebsiella pneumonia, femA (296 bp) của chủng Staphylococcus aureus, phoA
(890 bp) của chủng Escherichia coli và oprL (504 bp) của chủng Pseudomonas aeruginosa. Các mẫu bệnh phẩm còn lại bao gồm BN1 (đường
chạy 3), BN3 (đường chạy 5), BN5 (đường chạy 7), BN6 (đường chạy 8), BN7 (đường chạy 9), BN9 (đường chạy 11), BN11 (đường chạy 13), BN13 (đường chạy 15), BN14 (đường chạy 16), BN15 (đường chạy 17) cho kết quả âm tính. Mẫu đối chứng (đường chạy 1) là đối chứng âm cho kết quả âm tính chứng tỏ hóa chất mà chúng tôi sử dụng có độ tinh khiết cao và quá trình thao tác thí nghiệm đảm bảo không bị nhiễm. Các mẫu bệnh phẩm âm tính có thể là các chủng vi khuẩn gây bệnh khác hoặc có thể chứa chủng vi khuẩn quan tâm mà gen đích không được khuếch đại hoặc không có bất kỳ chủng vi khuẩn nào. Ngoài ra, trong tổng số 68 mẫu bệnh phẩm cấy máu mà chúng tôi khảo sát còn có các mẫu dương tính và âm tính khác. Do đó, để kh ng định kết quả, chúng tôi tiến hành so sánh kết quả multiplex PCR của 68 mẫu cấy máu này với kết quả cấy máu để đánh khả năng phát hiện sinh vật đích bằng phương pháp multiplex PCR. Kết quả so sánh được thể hiện ở Bảng 3.3 dưới đây.