Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng Master Mix mua từ các hãng khác nhau để chuẩn bị phản ứng PCR. Thông thường, thành phần cơ bản của master Mix bao gồm buffer, dNTPs, MgCl2, Taq polymerase. Tuy nhiên,
dNTPs, MgCl2 và loại Taq polymerase của mỗi hãng có nồng độ khác nhau.
Hơn nữa, nồng độ của các thành phần này ảnh hưởng rất lớn đến độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng PCR. Do đó, chúng tôi khảo sát 3 loại Master Mix trong phản ứng multiplex PCR nhiều gen đích để lựa chọn Master Mix.
Để lựa chọn được loại Master Mix có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, tiến hành lặp lại 3 lần, mỗi lần thực hiện 3 phản ứng multiplex PCR nhiều gen đích khác nhau, mỗi phản ứng đều giống nhau về thành phần khuôn DNA, mồi, chỉ khác nhau về loại Master Mix. Kết quả lựa chọn loại Master mix được điện di kiểm tra trên gel agarose 1% và được thể hiện trên Hình 3.7.
Hình ảnh điện di so sánh sản phẩm phản ứng multiplex PCR với 3 loại Master Mix khác nhau.1: Sản phẩm multiplex PCR với Master Mix hãng Invitrogen, 2: Sản phẩm multiplex PCR với Master Mix hãng Promega, 3. Sản phẩm multiplex PCR với Master Mix hãng Bioline, 4. Marker 1kb.5, 6, 7. Đối chứng âm (không có khuôn DNA).
Kết quả điện di trên hình 3.7 cho thấy, với Mastermix hãng Invitrogen (đường chạy 1) và Mastermix hãng Promega (đường chạy 2), sản phẩm multiplex PCR chỉ xuất hiện 3 băng tương ứng với 3 gen đích gồm mdh (364 bp), oprL (504 bp) và gltA (722 bp). Trong khi đó, với Mastermix hãng
Bioline (đường chạy 3) thì sản phẩm multiplex PCR xuất hiện cả 5 băng đặc hiệu tương ứng với 5 gen đích và không có băng phụ. Kết quả này chứng tỏ Mastermix của hãng 3 có độ nhạy, độ đặc hiệu tốt và phù hợp với phản ứng multiplex PCR nhằm phát hiện được đồng thời nhiều gen quan tâm trong cùng một phản ứng. Các đường chạy 5, 6, 7 là các mẫu đối chứng âm tương ứng với 3 Mastermix của các hãng không có bất kỳ băng nào xuất hiện chứng tỏ hóa chất của chúng tôi có độ tinh sạch cao và quá trình thao tác thí nghiệm không bị nhiễm.
3.4. Kết quả thử nghiệm phƣơng pháp multiplex PCR trên các chủng nhiễm khuẩn thuần
Sau khi đã tối ưu được nhiệt độ gắn mồi và lựa chọn được loại Mastermix có độ nhạy cao, chúng tôi tiến hành thử nghiệm phản ứng multiplex PCR trên 30 chủng vi khuẩn nuôi cấy thuần gồm Staphylococcus
aureus (n=5), Acinetobacter baumannii (n=5), Escherichia coli (n=5),
Pseudomonas aeruginosa (n=5) và Klebsiella pneumonia (n=5),
Bảng 3.2. Kết quả thử nghiệm phản ứng multiplex PCR Chủng vi khuẩn Tổng số chủng Số chủng đƣợc xét nghiệm cho kết quả dƣơng tính
femA gltA phoA oprL md h Staphylococcus aureus 5 5 − − − − Acinetobacter baumannii 5 − 5 − − − Escherichia coli 5 − − 5 − − Pseudomonas aeruginosa 5 − − − 5 − Klebsiella pneumoniae 5 − − − − 5 Streptococcus suis 5 _ _ _ _ _ Tổng số 30 5 5 5 5 5
Kết quả thu được ở bảng 1 cho thấy 25 chủng chứa gen đích gồm
Staphylococcus aureus (n=5), Acinetobacter baumannii (n=5), Escherichia
coli (n=5), Pseudomonas aeruginosa (n=5), Klebsiella pneumoniae (n=5) cho
kết quả dương tính, chủng vi khuẩn còn lại Streptococcus suis (n=5) cho kết
quả âm tính. Điều này chứng tỏ phản ứng multiplex PCR đã tối ưu có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, có khả năng khuếch đại chính xác gen đích trong chủng vi khuẩn quan tâm. Trong trường hợp này, kĩ thuật multiplex PCR chứng tỏ được độ nhạy và độ đặc hiệu là 100% trong việc phát hiện đúng các chủng vi khuẩn. Dự đoán giá trị âm tính và dương tính của kĩ thật multiplex PCR là 100%.
3.5. Kết quả thử nghiệm phƣơng pháp multiplex PCR trên mẫu bệnh phẩm
3.5.1. Kết quả thử nghiệm phƣơng pháp multiplex PCR trên các mẫu bệnh phẩm cấy máu
Nhằm mục tiêu đưa phương pháp multiplex PCR áp dụng vào thực tiễn để chẩn đoán và phát hiện nhanh nhiễm khuẩn huyết, chúng tôi thử nghiệm phương này trên mẫu bệnh phẩm cấy máu trước. Phương pháp multiplex PCR được thử nghiệm trên 68 mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân nghi ngờ nhiễm khuẩn huyết nhận được từ bệnh viện Thanh Nhàn. Các mẫu này đã được mã hóa để tăng tính khách quan cho thử nghiệm.
Đầu tiên, DNA của các chủng vi khuẩn từ 68 mẫu bệnh phẩm cấy máu được tách chiết bằng phương pháp đun sôi (theo mô tả phần vật liệu và phương pháp nghiên cứu). Tiếp theo, chúng tôi dùng DNA đã tách chiết được để làm khuôn cho phản ứng multiplex PCR. Kết quả multiplex PCR được điện di triểm tra trên gel agarose 1% và so sánh với kết quả cấy máu.
Hình 3.8. Thử nghiệm phƣơng pháp multiplex PCR trên mẫu bệnh phẩm cấy máu.
Hình ảnh điện di sản phẩm multiplex PCR trên một số mẫu bệnh phẩm cấy máu. 1. Đối chứng âm, 2. Marker 1kb, 3-17. Sản phẩm multiplex PCR của các mẫu BN1-BN15.
Kết quả điện di kiểm tra trên gel agarose cho thấy sản phẩm PCR của các mẫu bệnh phẩm BN2 (đường chạy 4), BN4 (đường chạy 6), BN8 (đường chạy 10), BN10 (đường chạy 12), BN12 (đường chạy 14) cho kết quả dương tính với các băng sáng rõ tương ứng với kích thước của các gen đích gltA
(722 bp) của chủng Acinetobacter baumannii, mdh (364 bp) của chủng Klebsiella pneumonia, femA (296 bp) của chủng Staphylococcus aureus, phoA
(890 bp) của chủng Escherichia coli và oprL (504 bp) của chủng Pseudomonas aeruginosa. Các mẫu bệnh phẩm còn lại bao gồm BN1 (đường
chạy 3), BN3 (đường chạy 5), BN5 (đường chạy 7), BN6 (đường chạy 8), BN7 (đường chạy 9), BN9 (đường chạy 11), BN11 (đường chạy 13), BN13 (đường chạy 15), BN14 (đường chạy 16), BN15 (đường chạy 17) cho kết quả âm tính. Mẫu đối chứng (đường chạy 1) là đối chứng âm cho kết quả âm tính chứng tỏ hóa chất mà chúng tôi sử dụng có độ tinh khiết cao và quá trình thao tác thí nghiệm đảm bảo không bị nhiễm. Các mẫu bệnh phẩm âm tính có thể là các chủng vi khuẩn gây bệnh khác hoặc có thể chứa chủng vi khuẩn quan tâm mà gen đích không được khuếch đại hoặc không có bất kỳ chủng vi khuẩn nào. Ngoài ra, trong tổng số 68 mẫu bệnh phẩm cấy máu mà chúng tôi khảo sát còn có các mẫu dương tính và âm tính khác. Do đó, để kh ng định kết quả, chúng tôi tiến hành so sánh kết quả multiplex PCR của 68 mẫu cấy máu này với kết quả cấy máu để đánh khả năng phát hiện sinh vật đích bằng phương pháp multiplex PCR. Kết quả so sánh được thể hiện ở Bảng 3.3 dưới đây.
Bảng 3.3. So sánh kết quả multiplex PCR trên các mẫu bệnh phẩm cấy máu
với kết quả của phƣơng pháp cấy máu ST
T Mã bệnh nhân Kết quả multiple PCR Kết quả cấy máu
1 BN1 Âm tính Âm tính
2 BN2 Acinetobacter baumannii Acinetobacter baumannii
3 BN3 Âm tính Cầu khuẩn Gr (+)
4 BN4 Klebsiella pneumonia Klebsiella pneumonia
5 BN5 Âm tính Âm tính
6 BN6 Âm tính Âm tính
7 BN7 Âm tính Trực khuẩn Gr(+)
8 BN8 Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus
9 BN9 Âm tính Cầu khuẩn Gr (+)
10 BN10 Escherichia coli Escherichia coli
11 BN11 Âm tính Âm tính
12 BN12 Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas
aeruginosa
13 BN13 Âm tính Trực khuẩn Gr(-)
14 BN14 Âm tính Trực khuẩn Gr(-)
15 BN15 Âm tính Nấm candida Knisie
16 BN16 Âm tính Cầu khuẩn Gr (+)
17 BN17 Âm tính Cầu khuẩn Gr (+)
18 BN18 Âm tính Âm tính
19 BN19 Âm tính Cầu khuẩn Gr (+)
20 BN20 Âm tính Cầu khuẩn Gr (+)
ST
T Mã bệnh nhân Kết quả multiple PCR Kết quả cấy máu
22 BN22 Âm tính Âm tính
23 BN23 Âm tính Trực khuẩn Gr(-)
24 BN24 Âm tính Cầu khuẩn Gr (+)
25 BN25 Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus
26 BN26 Âm tính Cầu khuẩn Gr (+)
27 BN27 Âm tính Streptococus Pneumonie
28 BN28 Âm tính Cầu khuẩn Gr (+)
29 BN29 Âm tính Nấm candida Knisie
30 BN30 Âm tính Nấm candida Knisie
31 BN31 Escherichia coli Escherichia coli
32 BN32 Âm tính Cầu khuẩn Gr (+)
33 BN33 Âm tính Trực khuẩn Gr(-)
34 BN34 Âm tính Cầu khuẩn Gr (+)
35 BN35 Âm tính Âm tính
36 BN36 Âm tính Trực khuẩn Gr(-)
37 BN37 Âm tính Âm tính
38 BN38 Âm tính Streptococcus
Pneumonie
39 BN39 Âm tính Nấm candida Knisie
40 BN40 Âm tính Pseudomonas sp
41 BN41 Âm tính Cầu khuẩn Gr (+)
42 BN42 Âm tính Trực khuẩn Gr(-)
43 BN43 Âm tính Trực khuẩn Gr(+)
44 BN44 Âm tính Âm tính
ST
T Mã bệnh nhân Kết quả multiple PCR Kết quả cấy máu
46 BN46 Escherichia coli Escherichia coli
47 BN47 Escherichia coli Escherichia coli
48 BN48 Âm tính Cầu khuẩn Gr (+)
49 BN49 Escherichia coli Escherichia coli
50 BN50 Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus
51 BN51 Klebsiella pneumonia Klebsiella pneumonia
52 BN52 Escherichia coli Escherichia coli
53 BN53 Âm tính Tụ cầu da
54 BN54 Escherichia coli Escherichia coli
55 BN55 Âm tính Tụ cầu da
56 BN56 Âm tính Âm tính
57 BN57 Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus
58 BN58 Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas
aeruginosa
59 BN59 Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus
60 BN60 Âm tính Tụ cầu da
61 BN61 Âm tính Trực khuẩn gram(-)
62 BN62 Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus
63 BN63 Âm tính Tụ cầuda
64 BN64 Escherichia coli Escherichia coli
65 BN65 Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus
66 BN66 Âm tính Tụ cầu da
67 BN67 Âm tính Âm tính
Dữ liệu thu được ở Bảng 3.3 cho thấy kết quả của phương pháp multiplex PCR hoàn toàn trùng khớp với kết quả cấy máu. Trong đó có 21 mẫu dương tính gồm 8 mẫu Staphylococcus aureus, 8 mẫu Escherichia coli, 1
mẫu Acinetobacter baumannii, 2 mẫu Klebsiella pneumonia và 2 mẫu
Pseudomonas aeruginosa. Kết quả này kh ng định rằng phương pháp
multiplex PCR có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, có khả năng phát hiện đồng thời và chính xác 5 chủng vi khuẩn khác nhau gây nhiễm khuẩn huyết. Hơn nữa, kết quả này còn cho thấy phương pháp multiplex PCR có độ tin cậy. Do đó, chúng tôi tiếp tục tiến hành thử nghiệm phương pháp multiplex PCR trực tiếp trên các mẫu lâm sàng.
3.5.2. Kết quả thử nghiệm phƣơng pháp multiplex PCR trên các mẫu lâm sàng
Mẫu lâm sàng mà chúng tôi sử dụng trong nghiên cứu này là 15 mẫu máu của các bệnh nhân nghi ngờ mắc nhiễm khuẩn huyết do bệnh viện Thanh Nhàn cung cấp.
Đầu tiên, DNA của vi khuẩn từ các mẫu máu được tách chiết bằng kit Qiagen theo chỉ dẫn của kit. Tuy nhiên, do vi khuẩn trong mẫu máu chưa qua nuôi cấy nên có số lượng ít và DNA thu được chứa phần lớn là DNA người. Do đó, chúng tôi xử lý DNA người, làm giàu DNA vi khuẩn trước khi tiến hành PCR. Kết quả của phản ứng multiplex PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1% và được thể hiện trên Hình 3.9.
Hình 3.9.Thử nghiệm phƣơng pháp multiplex PCR trên mẫu lâm sàng
Hình ảnh điện di sản phẩm multiplex PCR trên các mẫu lâm sàng (máu của bệnh nhân nghi nhiễm khuẩn huyết). 1-15. Sản phẩm multiplex PCR của 1-15
mẫu lâm sàng, 16. Marker 1kb, 17. Đối chứng âm.
Kết quả điện di trên gel agarose cho thấy sản phẩm PCR của các mẫu máu số 4 (đường chạy 4), 6 (đường chạy 6), 8 (đường chạy 8), 14 (đường chạy14) xuất hiện các băng sáng rõ có kích thước tương ứng với gen mdh
(364 bp) của chủng Klebsiella pneumonia, phoA (890 bp) của chủng
Escherichia coli, femA (296 bp) của chủng Staphylococcus aureus và gltA
(722 bp) của chủng Acinetobacter baumannii. Riêng mẫu số 12 (đường chạy 12) xuất hiện hai băng có kích thước 364 bp (mdh) và 890 bp (phoA). Như vậy, mẫu 4 dương tính với chủng Klebsiella pneumonia, mẫu 6 dương tính
với Escherichia coli, mẫu 8 dương tính với Staphylococcus aureus, mẫu 14
dương tính với Acinetobacter baumannii, mẫu 12 dương tính với Klebsiella pneumonia và Escherichia coli. Mẫu đối chứng âm (đường chạy 17) cho kết
quả âm tính chứng tỏ hóa chất mà chúng tôi sử dụng có độ tinh khiết cao và quá trình thao tác thí nghiệm đảm bảo không bị nhiễm. Kết quả thu được cho thấy phương pháp multiplex PCR có độ nhạy, độ đặc hiệu cao và hiệu quả trong việc phát hiện nhanh và đồng thời các sinh vật đích trên mẫu lâm sàng.
Phương pháp multiplex PCR có nhiều ưu điểm nổi bật trong việc phát hiện nhanh và đồng thời nhiều vi khuẩn đích so với PCR đơn mồi. Kĩ thuật multiplex PCR cũng được thiết lập dễ dàng ở nhiều phòng thí nghiệm bao gồm các phòng thí nghiệm y học và thực phẩm miễn là các phòng thí nghiệm đó được trang bị máy PCR.
Mặc dù hầu hết các phương pháp nuôi cấy truyền thống vẫn hữu dụng và có giá trị, song phương pháp phát hiện nhanh các chủng vi khuẩn gây bệnh như PCR là công cụ không thể thiếu ở các phòng thí nghiệm vi sinh y học. Phát hiện các chủng gây nhiễm khuẩn bằng phương pháp nuôi cấy truyền thống và các xét nghiệm hóa sinh có thể mất 5 ngày để có kết quả, trong khi đó PCR chỉ cần khoảng 5 giờ. Việc chẩn đoán nhanh rất quan trọng đối với bệnh nhân để có liệu pháp điều trị hợp lý, giảm được thời gian nằm viện và chi phí điều trị.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN
Từ các kết quả thu được trong công trình nghiên cứu này, chúng tôi đưa ra một số kết luận sau:
1. Đã lựa chọn và thiết kế thành công 5 cặp mồi đặc hiệu 5 gen đích của các chủng nhiễm khuẩn huyết gồm Staphylococcus aureus, Klebsiella
pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Escherichia coli và Pseudomonas
aeruginosa.
2. Đã tối ưu và lựa chọn được nồng độ mồi femA là 0.5 µM và các mồi
oprL là 0.3 µM, mdh là 0.3 µM, gltA là 0.3 µM, phoA là 0.3 µM nhiệt độ gắn
mồi tối ưu là 59oC, Master Mix tốt nhất là Master Mix hãng Bioline
3. Thử nghiệm thành công phương pháp multiplex PCR trên 68 mẫu bệnh phẩm cấy máu và 15 mẫu máu. Kết quả tương đồng với phương pháp nuôi cấy (phát hiện 5 tác nhân gây bệnh Staphylococcus aureus, Klebsiella
pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Escherichia coli và Pseudomonas
aeruginosa).
KIẾN NGHỊ
1. Xác định ngưỡng phát hiện của phản ứng multiplex PCR.
2. Tạo bộ kit phát hiện nhanh vi khuẩn gây nhiễm khuẩn huyết bằng phương pháp multiplex PCR.
TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT
1. Nguyễn Đạt Anh, Đặng Quốc Tuấn (2012), Tình trạng sepsis nặng và sốc nhiễm khuẩn, Hồi sức cấp cứu và chống độc, Bệnh viện Bạch Mai, tr.11-18. 2. Nguyễn Thị Thanh Hà (2015), Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng và vi sinh ở
bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết do Acinetobacter baumannii, Luận án tiến sĩ, Viện nghiên cứu khoa học y dược lâm sàng 108, Bộ Quốc Phòng, Bộ GD&ĐT.
3. Nguyễn Văn Kính (2008), Phân tích thực trạng sử dụng kháng sinh tại Việt Nam, GARP Việt nam, http://www.cddep.org/sites/cddep.org truy cập ngày 16/11/ 2013.
4. Vũ Đình Phú (2013), Khảo sát nhiễm trùng bệnh viện và sử dụng kháng sinh tại khoa Hồi sức tích cực ở Việt Nam, Hội nghị kháng kháng sinh Châu Á, Bệnh viện Bạch Mai.
5. Phùng Thị Bích Thủy, Khúc Thị Rềnh Hoa, Phan Thu Chung, Tạ Anh Tuấn, Nguyễn Thanh Liêm (2012), “Ứng dụng kỹ thuật real time PCR đa mồi trong chẩn đoán các căn nguyên gây nhiễm trùng huyết ở trẻ em tại Bệnh viện Nhi trung ương”, Tạp chí y học Việt Nam, tháng 9 – số đặc biệt 2012 tập 397, tr. 336-341.
6. Phạm Hùng Vân và Tập thể (2010), "Nghiên cứu đa trung tâm về tình hình đề kháng imipenem và meropenem của trực khuẩn gram âm dễ mọc kết quả trên 16 bệnh viện tại việt nam", Tạp chí Y học Tp. HCM, 14 (2), tr.280-286.
TIẾNG ANH
7. Anbazhagan D., Mui W. S., Mansor M., Yan G. O., Yusof M. Y., Sekaran S.D. (2011), “Development of conventional and real-time multiplex PCR assays for the detection of nosocomial pathogens”, Braz J Microbiol., 42(2), pp. 448-458.
definitions for sepsis, septic shock, acute lung injury, and acute respiratory distress syndrome: time for a reevaluation”, Critical Care Medicine, 28(1), pp. 232–235.
9. Angus D. C, Linde-Zwirble W. T., Lidicker J., Clermont G., Carcillo J. (2001), “Epidemiology of severe sepsis in the United States: analysis of incidence, outcome, and associated costs of care”, Critical Care Medicine, 29(7), pp. 1303–1310.
10. Angus D. C., Van der Poll T. (2013), “Severe sepsis and septic shock”, The New England Journal of Medicine, 369(9), pp. 840–851.
11. Anthony A. L., Folasade T. O., Rita O. O., Oyin O. O., Ibironke D., Chukwudi C. E., Agwu U. N., Comfort N. A., Ita O. L., Godwin I. O. (2016), “Incidence, Clinical Outcome and Risk Factors of Intensive Care Unit Infections in the Lagos University Teaching Hospital (LUTH), Lagos, Nigeria”, Plos one, DOI:10.1371.
12. Artero A., Zaragoza R., Nogueira J. M. (2012), Epidemiology of Severe Sepsis and Septic Shock, Severe Sepsis and Septic Shock, In Tech, www.intechopen.com, Aceess on 16 feb 2013.
13. Aydemir O., Aydemir Y., Ozdemir M. (2014), “The role of multiplex PCR test in identification of bacterial pathogens in lower respiratory tract infections”, Pak J Med Sci., 30(5), pp. 1011-1016.
14. Barenfanger J, Graham D. R., Kolluri L., Sangwan G., Law-horn J. (2008),