Tuân thủ theo các quy định trong Quy chế hoạt động của Hội đồng đạo đức trong nghiên cứu y sinh học ban hành kèm theo Quyết định số 5129/2002/QĐ - BYT ngày 19/12/2002 của Bộ trưởng Bộ Y tế.
Các bệnh nhân tham gia vào nghiên cứu đều được giải thích, được cung cấp thông tin đầy đủ trước khi tham gia nghiên cứu. Các bệnh nhân nghiên cứu (hoặc người thân của bệnh nhân) đều có quyền tự nguyện chấp thuận tham gia nghiên cứu, cũng như được quyền từ chối tham gia nghiên cứu bất kỳ lúc nào, với bất kỳ lý do gì.
Các kết quả nghiên cứu chỉ sử dụng vào mục đích phục vụ cho nghiên cứu này, không được sử dụng cho mục đích nào khác. Các thông tin cá nhân của bệnh nhân sẽ được đảm bảo bí mật. Không công bố tên của cá nhân bệnh nhân trên các bản công bố kết quả nghiên cứu (tạp chí khoa học, bài báo cáo Hội nghị khoa học...).
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả lựa chọn và thiết kế mồi đặc hiệu gen đích
Các chủng vi khuẩn gây nhiễm khuẩn huyết phổ biến Staphylococcus aureus, Acinetobacter baumannii, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae và
Pseudomonas aeruginosa được phòng Vi sinh vật bệnh viện Thanh Nhàn
phân lập từ bệnh nhân bằng phương pháp phân lập trên các môi trường thạch: thạch máu Columbia, thạch chocolate, môi trường Bromocresol purple, sử dụng máy cấy máu tự động batex với môi trường chai cấy ái khí của biomerieux. Định danh vi khuẩn bằng bộ định danh vi khuẩn API 20E của hãng Biomeieux (Pháp). Chúng tôi tiếp nhận các chủng này, sau đó tiến hành định danh thêm bằng phương pháp sinh học phân tử (phần kết quả này không trình bày ở đây) trước khi sử dụng cho các nghiên cứu về xây dựng phản ứng multiplex PCR xác định đồng thời 5 tác nhân gây bệnh nêu trên.
Gen phoA là một gen quản gia mã cho alkaline photphatase, phoA được một số nhà khoa học lựa chọn là đích để phát hiện Escherichia coli [43, 75].
PhoA cùng với các gen khác cũng được lựa chọn là gen đích để phát hiện
Escherichia coli bằng PCR đa mồi [77].
Staphylococcus aureus tổng hợp cầu nối peptidoglycan interpeptide
pentaglycine nhờ xúc tác của các peptidyl transferase FemX, FemA và FemB. Khi bất hoạt gen femA dẫn đến sự suy giảm peptidoglycan monoglycine là
một cơ chất của protein gắn penicilin (PBPs) cũng như làm cho thấp ái lực với tiểu phần PBP2a một sản phẩm được mã hóa bởi gen MecA và dẫn tới
giảm khả năng kháng kháng sinh. Do đó FemX hoặc FemA được xem như các gen đích tiềm năng trong việc phát hiện các chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus mới có tính kháng kháng sinh cao. Các sản phẩm do gen femA mã hóa
các chủng Staphylococcus aureus được phân lập. Trong số các sản phẩm do gen femA mã hóa có một protein 48 kDa từng được chỉ ra có liên quan trong quá trình chuyển hóa tế bào và được tìm thấy với số lượng lớn trong môi trường nuôi cấy [75].
Trong nghiên cứu này, gen femA của chủng Staphylococcus aureus
được nhân bản bằng cặp mồi femAR/F. Kích thước của sản phẩm PCR là 296 bp, tham khảo trình tự mồi của Mehrotra và tập thể (2000) [58].
Đối với chủng Acinetobacter baumannii, gen gltA là gen quản gia mã hóa cho enzyme tổng hợp citrate được chúng tôi lựa chọn là gen đích. GltA
được Bartual và tập thể (2005) lựa chọn để nghiên cứu [15]. Trong nghiên cứu này, các tác giả đã khuếch đại gen gltA cùng 6 gen quản gia khác là DNA gyrase subunit B (gyrB), glucose dehydrogenase B (gdhB), homologous recombination factor (recA), 60-kDa chaperonin (cpn60), glucose-6- phosphate isomerase (gpi), RNA polymerase 70 factor (rpoD), phospho- glucomutase (pgm), quinate shikimate dehydrogenase (quiA) và coenzyme A thiolase (pcaf). Trong 7 gen này GltA được xem như có tính bảo thủ cao và
phù hợp hơn các gen còn lại [15, 76].
Các protein liên kết màng của Pseudomonas aeruginosa đóng vai trò quan trọng trong sự tương tác của vi khuẩn với môi trường đồng thời cũng là một trong những nguyên nhân dẫn đến sự kháng kháng sinh hoặc có ảnh hưởng nhất định đến sự vận chuyển qua màng của tế bào. Daniel và tập thể (1997) đã khuếch đại 2 gen đặc trưng mã hóa cho lipoprotein bám màng là
oprI và oprL. Các nghiên cứu đều chỉ ra rằng oprL có tính bảo thủ rất cao
giữa các chủng Pseudomonas aeruginosa. Do đó gen oprL được lựa chọn làm gen đích để phát hiện Pseudomonas aeruginosa [25].
Thong và tập thể (2011) đã lựa chọn 6 gen TonB, infB, gyrB, mdh,
thử nghiệm được thường bị đột biến ở các loài khác nhau và thậm chí cả trong các chủng khác nhau của cùng một loài. Hơn nữa, trình tự của gen Parc là rất giàu C/G dẫn đến mồi thiết kế dễ tạo thành cấu trúc kẹp tóc hoặc dimer. Gen
23s-rRNA và Gen gyrB có số bản sao thấp trong hệ gen. Do đó gen mdh được
lựa chọn để phát hiện Klebsiella pneumoniae [76].
Như vậy, sau khi tham khảo các tài liệu, chúng tôi lựa chọn được các gen đích gltA cho chủng Acinetobacter baumannii, gen phoA là gen đích của chủng Escherichia coli, gen femA là gen đích của chủng Staphylococcus
aureus, gen mdh là gen đích của chủng Klebsiella pneumoniae, gen oprL lựa
chọn là gen đích của chủng Pseudomonas aeruginosa. Sựa lựa chọn này
tương đồng với nghiên cứu của Thong và tập thể (2011) [76]. Sau khi tham khảo trình tự các primer của các tác giả khác đã công bố, chỉnh sửa và thiết kế mới bằng phần mềm primer 3 plus, PrimerPlex, kiểm tra bằng công cụ BLAST (http://www.ncbi.nih.gov) để giảm thiểu khả năng nhân gen không đặc hiệu từ locut không phải là đích. Sau đó các cặp mồi đã được lựa chọn đó được kiểm tra bằng chương trình phần mềm insilico PCR (http://insilico.ehu.es/PCR/) dự đoán sản phẩm PCR (amplicon); kiểm tra bằng các phần mềm online (protocol-online.org). Chúng tôi đã lựa chọn và thiết kế được trình tự mồi được liệt kê ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Trình tự mồi và kích thƣớc sản phẩm PCR theo tính toán lý thuyết Tên mồi Trình tự Kích thƣớc sản phẩm gltA Fw: 5’ ATTTACAGTGGCACATTAGGT 3’ Rv: 5’ GCAGAGATACCAGCAGAGAT 3’ 722 bp phoA Fw: 5’ AAGCCCGGACACCATAAATGC 3’ 890 bp
Rv: 5’ TCATTACGTTGCGGATTTGGC 3’ Oprl Fw: 5’ ATGGAATAGCTGAAATTCGG 3’ Rv: 5’ CTTCTTCAGCTCGACGCGA 3’ 504 bp Mdh Fw: 5’ GCGTGGCGGTAGATCTAAGTCA 3’ Rv: 5’ TTCAGCTCCGCCACAAAGGTA 3’ 364 bp femA Fw: 5’ CTCTTGCTGGTTTCTTCTTTATC 3’ Rv: 5’ GTGCGGTATATGCTGCGTAA 3’ 296 bp
3.2. Kết quả kiểm tra các cặp mồi bằng thực nghiệm
3.2.1. Kiểm tra DNA tổng số tách chiết từ các chủng vi khuẩn
Các cặp primer sau khi thiết kế được đặt tổng hợp, tiến hành kiểm tra trên các mẫu DNA của các chủng chuẩn bệnh viện Thanh nhàn cung cấp. DNA tổng số của các chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus, Acinetobacter
baumannii, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae và Pseudomonas
aeruginosa được tách chiết như đã giới thiệu ở phần phương pháp và được
điện di kiểm tra trên gel agarose 1 % (Hình 3.1).
Hình 3.1. Điện di kiểm tra DNA tổng số của các chủng Staphylococcus
aureus, Acinetobacter baumannii, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae
Đường chạy 1-3:DNA tách chiết từ các chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus; 4-6: DNA tách chiết từ các chủng vi khuẩn Acinetobacter baumannii; 7-9; DNA tách chiết từ các chủng vi khuẩn Escherichia coli; 10- 12: DNA tách chiết từ các chủng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa; 13-15: DNA tách chiết từ các chủng vi khuẩn Klebsiella pneumoniae.
Kết quả điện di DNA tổng số cho thấy các băng DNA sáng rõ có độ di động thấp gần với vạch xuất phát và không bị phân cắt thành từng vệt chứng tỏ rằng DNA tổng tách được còn nguyên vẹn không bị đứt gãy, đạt hàm lượng và độ sạch cần thiết cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.2.2. Kết quả PCR kiểm tra từng cặp mồi đơn trên các chủng vi khuẩn đích đích
Tiếp theo, chúng tôi tiến hành phản ứng PCR đơn mồi với các cặp mồi đặc hiệu các gen đích tương ứng để xác định độ đặc hiệu. Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1% và được thể hiện trên Hình 3.2.
Kết quả điện di trên gel agarose cho thấy ở tất cả các giếng đều xuất hiện các băng đậm rõ nét có kích thước tương ứng khoảng 296 bp (đường chạy 1-3), 364 bp (đường chạy 4-6), 504 bp (đường chạy 7-9), 722 bp (đường chạy 10-12), 890 bp (đường chạy 13-15) phù hợp với tính toán lý thuyết về kích thước của các gen femA của chủng Staphylococcus aureus, mdh của
chủng Klebsiella pneumoniae, gen oprL của chủng Pseudomonas aeruginosa,
gltA của chủng Acinetobacter baumannii, và gen phoA của chủng Escherichia
coli. Kết quả PCR chứng tỏ tất cả các cặp mồi đã kiểm tra đều đặc hiệu với
các sinh vật đích vì các gen dự đoán đều được khuếch đại. Tuy nhiên để kh ng định chắc chắn các gen nhân bản được chính là các gen đích, sản phẩm PCR từ các chủng được lựa chọn tiến hành xác định trình tự.
Hình 3.2. Kiểm tra tính đặc hiệu của các cặp mồi và các gen đích của các chủng vi khuẩn gây nhiễm khuẩn huyết tƣơng ứng.
Cặp mồi phoA khuếch đại gen phoA (Escherichia coli), cặp mồi gltA khuếch
đại gen gltA (Acinetobacter baumannii), cặp mồi oprL khuếch đại gen oprL
(Pseudomonas aeruginosa), cặp mồi mdh khuếch đại gen mdh (Klebsiella
pneumonia), cặp mồi femA khuếch đại gen femA (Staphylococcus aureus).
Đường chạy 1-3: sản phẩm PCR gen femA (theo lý thuyết 296 bp), 4-6: sản
phẩm PCR gen mdh (theo lý thuyết là 364 bp), 7-9: sản phẩm PCR gen oprL (theo lý thuyết là 504 bp),: 10-12: sản phẩm PCR gen gltA (theo lý thuyết là 722 bp), 13-15: sản phẩm PCR gen phoA (theo lý thuyết là 890 bp), 16:
Marker 1 kb (Fermentas). 17: Đối chứng âm.
3.2.3. Kết quả xác định trình tự các sản phẩm PCR từ các chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus, Acinetobacter baumannii, Escherichia coli,
Klebsiella pneumoniae và Pseudomonas aeruginosa
Để kh ng định quá trình khuếch đại đã nhân được chính xác các gen đích, chúng tôi tiến hành phân tích trình tự DNA của các sản phẩm PCR với mồi tương ứng. Kết quả thu được được trình bày ở phần dưới đây.
> Trình tự gen oprL của Pseudomonas aeruginosa
1 atggaaatgc tgaaattcgg caaatttgct gcgctggctc tggccatggc 51 TGTAGCTGTG GGTTGCTCCT CCAAGGGCGG CGACGCTTCC GGTGAAGGTG 101 CCAACGGCGG CGTCGACCCG AACGCAGGCT ATGGCGCTAA CAGCGGTGCC 151 GTTGACGGCA GCCTGAGCGA CGAAGCCGCT CTGCGTGCGA TCACCACCTT 201 CTACTTCGAG TACGACAGCT CCGACCTGAA GCCGGAAGCC ATGCGTGCTC 251 TGGACGTACA TGCAAAAGAC CTGAAAGGCA GCGGTCAGCG CGTAGTCCTG 301 GAAGGCCACA CCGACGAACG TGGTACCCGC GAGTACAACA TGGCCCTGGG 351 CGAGCGTCGT GCCAAGGCCG TTCAGCGTTA CCTGGTACTG CAGGGCGTGT 401 CCCCGGCTCA GCTGGAACTG GTTTCCTACG GTAAGGAGCG TCCGGTTGCC 451 ACTGGCCACG ACGAGCAGTC CTGGGCCCAG AACCGTCGCG TCGAGCTGAA 501 GAAG
> Trình tự gen gltA của Acinetobacter baumannii
1 atttacagtg gcacattagg tcccgatgta atcgacgtta aagatgtatt 51 ggcctcaggt cactttacTT TTGATCCTGG TTTTATGGCG ACAGCTTCAT 101 GCGAGTCTAA AATCACATTT ATCGATGGTG ACAAAGGTAT TTTATTACAC 151 CGCGGTTACC CGATTGACCA GTTAGCGACT CAAGCAGACT ACCTTGAAAC 201 TTGTTATTTA TTATTAAATG GCGAGTTACC AACTGCTGAA CAAAAAGTTG 251 AGTTCGATGC GAAAGTTCGT GCTCATACTA TGGTTCATGA TCAAGTTAGC 301 CGTTTCTTCA ATGGTTTCCG TCGTGATGCT CACCCTATGG CAATCATGGT 351 TGGTGTAGTA GGCGCATTAT CTGCTTTCTA TCACAACAAC CTTGACATTG 401 AAGACATCAA CCACCGCGAA ATTACTGCGA TTCGTTTGAT TGCTAAAATT 451 CCAACGCTTG CTGCTTGGAG CTACAAATAT ACTGTAGGTC AGCCATTCAT 501 CTATCCACGT AATGACTTAA ATTACGCGGA AAACTTCTTA CACATGATGT 551 TTGCAACTCC TGCAGACCGT GACTACAAAG TAAACCCTGT TCTTGCTCGT 601 GCAATGGATC GTATCTTTAC GCTTCATGCT GACCACGAAC AAAACGCGTC 651 TACTTCTACA GTTCGACTTG CTGGTTCTAC TGGTGCGAAC CCATATGCGT 701 GTATCTCTGC TGGTATCTCT GC
> Trình tự gen phoA của Escherichia coli
1 aagcccggac accagaaatg cctgttctgg aaaaccgggc tgctcagagc 51 CGATATTACT GCACCCGGCG GTGCTCGCCG CTTAACGGGT GATCAGACCG 101 CTGCTCTGCG TGATTCTCTT AGCGATAAAC CTGCAAAAAA TATTATTTTG
151 CTGATTGGCG ATGGGATGGG GGACTCGGAA ATTACTGCCG CACGCAATTA 201 TGCCGAAGGT GCGGGCGGCT TTTTTAAAGG TATCGATGCC TTACCGCTTA 251 CCGGGCAATA CACTCACTAT GCGCTGAATA AAAAAACCGG CAAACCGGAC 301 TACGTCACCG ACTCGGCTGC ATCAGCAACC GCCTGGTCAA CTGGTGTCAA 351 AACCTATAAC GGCGCGCTGG GCGTCGATAT TCACGAAAAA GATCACCCAA 401 CGATTCTGGA AATGGCAAAA GCCGCAGGTC TGGCGACCGG TAACGTTTCT 451 ACCGCAGAGT TGCAGGATGC CACGCCCGCT GCGCTGGTGG CGCATGTGAC 501 CTCGCGCAAA TGCTACGGTC CAAGTGCGAC CAGTGAAAAA TGTCCGGGTA 551 ACGCTCTGGA AAAAGGCGGA AAAGGATCGA TTACCGAACA GCTGCTTAAC 601 GCCCGTGCCG ATGTTACGCT TGGCGGCGGT GCAAAAACCT TTGCTGAAAC 651 GGCAACCGCC GGTGAATGGC AGGGAAAAAC GCTGCGTGAA CAGGCACAGG 701 CGCGTGGTTA TCAGTTGGTG AGCGATGCTG CCTCACTGAA TTCGGTGACG 751 GAAGCGAATC AGCAAAAACC CCTATTAGGA CTGTTTGCTG ACGGCAATAT 801 GCCAGTGCGC TGGCAAGGAC CGAAAGCAAC GTACCACGGT AATATAGATA 851 AGCCCGCAGT CACCTGTACG CCAAATCCGC AACGTAATGA
> Trình tự gen mdh của Klebsiella pneumoniae
1 gcgtggcggt agatctaagt catatcccca cagatgtaaa aattaaagGA 51 TTTTCCGGTG AAGACGCTAC TCCGGCGCTG GAAGGCGCGG ATGTAGTGCT 101 GATCTCCGCG GGCGTGGCGC GTAAGCCCGG CATGGATCGT TCCGACCTGT 151 TTAATGTGAA TGCGGGTATC GTGAAGAACC TCGTGCAGCA GATTGCCAAA 201 ACCTGCCCGC AGGCCTGCAT CGGCATTATC ACCAACCCGG TGAATACCAC 251 CGTGGCTATC GCCGCCGAAG TACTGAAAAA AGCCGGCGTG TACGATAAAA 301 ACAAACTGTT CGGCGTTACC ACGCTGGACA TCATCCGTTC CAATACCTTT 351 GTGGCGGAGC TGAA
> Trình tự gen FemA của Staphylococcus aureus
1 CTCTGCTGGT TTCTTCTTTA TCAATCCATT TGAAGTTGTT TATTATGCTG 51 GTGGTACATC AAATGCATTC CGCCATTTTG CCGGAAGTTA TGCAGTGCAA 101 TGGGAAATGA TTAATTATGC ATTAAATCAT GGCATTGACC GTTATAATTT 151 CTATGGTGTT AGTGGTAAAT TTACAGAAGA TGCTGAAGAT GCTGGTGTAG 201 TTAAATTCAA AAAAGGTTAC AATGCTGAAA TTATTGAATA TGTTGGTGAC
Kết quả phân tích Blast cho thấy trình tự thu được có độ tương đồng cao từ 98% đến 100% với các trình tự của các chủng vi khuẩn tương ứng trên GenBank (phụ lục 1- 10). Như vậy các cặp primer đã thiết kế nhân bản được chính xác các gen đích của các vi khuẩn đích với đúng kích thước mong muốn: Gen phoA của Escherichia coli có kích thước 890 bp; gen GltA của
Acinetobacter baumannii có kích thước 722 bp; gen OprL của
Pseudomonas aeruginosa có kích thước 504 bp; gen Mdh của Klebsiella
pneumoniae có kích thước 364 bp; gen FemA của Staphylococcus aureus
có kích thước 296 bp.
3.2.4. Kiểm tra tính đặc hiệu của các cặp mồi
Để kiểm tra tính đặc hiệu của các mồi được thiết kế, chúng tôi sử dụng DNA của 5 chủng lần lượt Staphylococcus aureus, Acinetobacter baumannii,
Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae và Escherichia coli làm
khuôn cho các phản ứng PCR sử dụng từng cặp mồi riêng biệt femA, gltA, oprL, mdh, phoA cho mỗi phản ứng. Kết quả thể hiện trên Hình 3.3.
A B
Hình 3.3. Kiểm tra khả năng nhân bản đặc hiệu của các cặp mồi femA, gltA, oprL, mdh, phoA với các chủng Staphylococcus aureus,
Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella
pneumoniae và Escherichia coli.
aeruginosa, Klebsiella pneumoniae và Escherichia coli; 7-11: PCR cặp mồi
oprL với 5 chủng Staphylococcus aureus, Acinetobacter baumannii,
Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae và Escherichia coli; 12-16:
PCR cặp mồi mdh với 5 chủng Staphylococcus aureus, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae và Escherichia
coli . Hình 3.3B. 6: Thang chuẩn DNA 1 kb; 1-5: PCR cặp mồi femA với 5
chủng Staphylococcus aureus, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas
aeruginosa, Klebsiella pneumoniae và Escherichia coli; 7-11: PCR cặp mồi
phoA với 5 chủng Staphylococcus aureus, Acinetobacter baumannii,
Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae và Escherichia coli.
Kết quả điện di cho thấy với mồi gltA chỉ xuất hiện băng 722 bp với khuôn là chủng Acinetobacter baumanii (Hình 3.3A đường chạy 4) Trong khi 4 đường chạy còn lại không xuất hiện băng chứng tỏ rằng mồi gltA thiết kế đặc hiệu
cho riêng chủng Acinetobacter baumanii
Tương tự, mồi oprL chỉ thấy băng 504 bp với khuôn là Pseudomonas aeruginosa (đường chạy 7 Hình 3.3A) và không thu được băng nào trong các
đường chạy sử dụng 4 chủng còn lại làm khuôn.
Mồi mdh chỉ cho băng 364 bp (Hình 3.3 A, đường chạy 14) khi sử dụng khuôn tương ứng là DNA của Klebsiella pneumonia đồng thời cũng không
xuất hiện băng khi sử dụng 4 chủng còn lại làm khuôn cho các phản ứng. Mồi femA chỉ cho băng 296 bp (Hình 3.3 B đường chạy 4) khi sử dụng khuôn là DNA của Staphylococcus aureus.
Mồi phoA chỉ xuất hiện một băng 890 bp duy nhất, là băng đặc trưng
cho kích thước của gen phoA của Escherichia coli (Hình 3.3 B đường chạy 11).
Kết quả trên chứng tỏ rằng từng cặp mồi được thiết kế đặc trưng cho từng chủng vi khuẩn quan tâm, không có khả năng bắt cặp chéo hay bắt cặp
nhầm giữa các chủng vi khuẩn khác nhau và thể hiện tính đặc hiệu cao với 5 loài vi khuẩn được nghiên cứu.
3.2.5 Kết quả kiểm tra tính đặc hiệu của các cặp mồi và các gen đích trong phản ứng multiplex PCR trong phản ứng multiplex PCR
Phản ứng multiplex PCR được thiết kế dựa trên phản ứng PCR chuẩn với tổng thể tích của một phản ứng là 25 µl bao gồm Mastermix, mồi, khuôn DNA và nước khử ion. Tuy nhiên, trong phản ứng multiplex PCR có bổ sung thêm các cặp mồi để phát hiện đồng thời nhiều gen khác nhau. Việc bổ sung này làm cho nồng độ các thành phần thay đổi so với phản ứng PCR chuẩn, đồng thời có thể xảy ra hiện tượng các cặp mồi ức chế, bắt cặp chéo lẫn nhau dẫn đến không phát hiện được gen đích quan tâm. Do đó, chúng tôi tiến hành phản ứng multiplex PCR để kiểm tra độ đặc hiệu của các cặp mồi và các gen đích tương ứng. Kết quả phản ứng multiplex PCR được kiểm tra trên gel agarose 1% và được thể hiện trên Hình 3.4.
Hình 3.4. Kiểm tra tính đặc hiệu giữa các cặp mồi và các gen đích trong phản ứng multiplex PCR.
(A): Phản ứng multiplex PCR một gen đích: 1: đối chứng âm (không có khuôn DNA), 2: marker 1 kb, 3: sản phẩm PCR gen phoA (890 bp), 4: sản
phẩm PCR gen gltA (722 bp), 5: sản phẩm PCR gen oprL (504 bp), 6: sản
phẩm PCR gen mdh (364 bp), 7: sản phẩm PCR gen femA (296 bp). (B): Phản ứng multiplex PCR nhiều gen đích: 1: đối chứng âm (không có khuôn DNA), 2: marker 1kb, 3: hỗn hợp sản phẩm multiplex PCR các gen phoA, gltA, oprL, mdh, và femA.