trong phản ứng multiplex PCR
Phản ứng multiplex PCR được thiết kế dựa trên phản ứng PCR chuẩn với tổng thể tích của một phản ứng là 25 µl bao gồm Mastermix, mồi, khuôn DNA và nước khử ion. Tuy nhiên, trong phản ứng multiplex PCR có bổ sung thêm các cặp mồi để phát hiện đồng thời nhiều gen khác nhau. Việc bổ sung này làm cho nồng độ các thành phần thay đổi so với phản ứng PCR chuẩn, đồng thời có thể xảy ra hiện tượng các cặp mồi ức chế, bắt cặp chéo lẫn nhau dẫn đến không phát hiện được gen đích quan tâm. Do đó, chúng tôi tiến hành phản ứng multiplex PCR để kiểm tra độ đặc hiệu của các cặp mồi và các gen đích tương ứng. Kết quả phản ứng multiplex PCR được kiểm tra trên gel agarose 1% và được thể hiện trên Hình 3.4.
Hình 3.4. Kiểm tra tính đặc hiệu giữa các cặp mồi và các gen đích trong phản ứng multiplex PCR.
(A): Phản ứng multiplex PCR một gen đích: 1: đối chứng âm (không có khuôn DNA), 2: marker 1 kb, 3: sản phẩm PCR gen phoA (890 bp), 4: sản
phẩm PCR gen gltA (722 bp), 5: sản phẩm PCR gen oprL (504 bp), 6: sản
phẩm PCR gen mdh (364 bp), 7: sản phẩm PCR gen femA (296 bp). (B): Phản ứng multiplex PCR nhiều gen đích: 1: đối chứng âm (không có khuôn DNA), 2: marker 1kb, 3: hỗn hợp sản phẩm multiplex PCR các gen phoA, gltA, oprL, mdh, và femA.
Kết quả điện di trên gel agarose trên Hình 3.4A cho thấy các sản phẩm nhân gen bằng phản ứng multiplex PCR thu được đều đặc hiệu, phù hợp với tính toán về kích thước của các gen đích và không có sản phẩm phụ. Điều này chứng tỏ trong phản ứng multiplex PCR này các cặp mồi rất đặc hiệu với các gen đích, các cặp mồi không ức chế và bắt cặp chéo lẫn nhau. Để kh ng định chắc chắn về độ đặc hiệu của các cặp mồi với các gen đích trong cùng một phản ứng multiplex PCR, chúng tôi trộn DNA của 5 chủng vi khuẩn khác nhau tạo thành hỗn hợp DNA khuôn và tiến hành phản ứng multiplex PCR. Kết quả là, sản phẩm của phản ứng multiplex PCR này xuất hiện cả 5 băng đậm, rõ nét tương ứng với kích thước của 5 gen đích và không có băng phụ (Hình 3.4B, đường chạy 3). Ngoài ra, đường chạy 1 (Hình 3.4A) và đường chạy 1 (Hình 3.4B) là đối chứng âm không có băng nào xuất hiện chứng tỏ hóa chất được sử dụng trong thí nghiệm hoàn toàn tinh khiết, các bước thao tác không bị nhiễm và kết quả của chúng tôi thu được đáng tin cậy.
Kết quả nghiên cứu này của chúng tôi có một số điểm tương đồng với nghiên cứu của Thong và tập thể (2011) về việc lựa chọn các gen femA, gltA,
oprL, mdh, phoA để phát hiện 5 chủng vi sinh vật Staphylococcus aureus,
Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae
và Escherichia coli bằng phản ứng multiplex PCR [76].
Đồng thời nghiên cứu của chúng tôi cũng có điểm tương tự như một nghiên cứu của Daniel và tập thể (1997) khi tác giả sử dụng PCR đa mồi để phát hiện Pseudomonas aeruginosa dựa trên sự khuếch đại 2 gen
mã hóa licoprotein trên màng là oprI kích thước 249 bp và oprL kích
thước 504 bp [25].
3.3. Kết quả tối ƣu phản ứng multiplex PCR xác định đồng thời 5 vi khuẩn đích
3.3.1. Kết quả tối ƣu nồng độ mồi của phản ứng multiplex PCR
Mồi và nồng độ của mồi là yếu tố quyết định độ đặc hiệu của phản ứng PCR để nhân bản thành công gen đích. Do đó, để phản ứng multiplex PCR có hiệu quả cao, nồng độ các mồi cần phải được tối ưu. Trong nghiên cứu đã công bố của Thong và tập thể (2011), các tác giả đã tối ưu được nồng độ các mồi và thực hiện phản ứng multiplex PCR với thành phần phản ứng PCR bao gồm: 25 µl chứa 100 ng khuôn DNA, đệm 1X, các mồi gltA, phoA, oprL và
mdh đều có nồng độ 0.3 µM, mồi femA 0.5 µM, hỗn hợp dNTP 200 µM,
MgCl2 1.5 mM và Taq DNA polymerase (Promega, USA) 1U [76].
Trong nghiên cứu này, để tối ưu được nồng độ mồi, đầu tiên chúng tôi khảo sát tất cả các mồi ở nồng độ 0,3 µM. Kết quả điện di sản phẩm multiplex được thể hiện trên hình 3.5 (A).
Hình 3.5. Tối ƣu nồng độ mồi cho phản ứng multiplex PCR.
(A). Hình ảnh điện di sản phẩm multiplex PCR với nồng độ mỗi mồi là 0,3 µM. Đường chạy 1. Sản phẩm PCR gen oprL (504 bp), 2. sản phẩm PCR gen
(890 bp), 5. Thang DNA chuẩn, 6. Sản phẩm PCR gen femA; (B). Hình ảnh điện di sản phẩm multiplex PCR với nồng độ mồi femA là 0,5 µM, nồng độ
các mồi còn lại là 0,3 µM. Đường chạy 1. Sản phẩm PCR gen femA (296 bp), 2. Sản phẩm PCR gen mdh (364 bp), 3. Sản phẩm PCR gen oprL (504 bp), 4. sản phẩm PCR gen gltA (722 bp), 5. sản phẩm PCR gen phoA (890 bp), 6.
Sản phẩm multiplex PCR, 7. Thang DNA chuẩn 1 kb, 8. Đối chứng âm.
Kết quả điện di trên Hình 3.5 (A) cho thấy, ở nồng độ các mồi là 0,3 µM chỉ có các gen oprL, gtlA, mdh và phoA được khuếch đại với các kích
tương ứng là 504 bp (đường chạy 1), 722 bp (đường chạy 2), 364 bp (đường chạy 3) và 890 bp (đường chạy 3). Đường chạy 6 là sản phẩm PCR của gen
femA nhưng không có băng nào xuất hiện. Như vậy, ở nồng độ mồi femA là
0,3 µM, gen femA không được khuếch đại. Do đó, chúng tôi tăng nồng độ mồi
femA lên 0,5 µM, nồng độ các mồi khác vẫn giữ là 0,3 µM. Tiếp theo chúng
tôi tiến hành 5 phản ứng multiplex PCR với khuôn là DNA của 5 chủng vi khuẩn quan tâm, 1 phản ứng multiplex PCR với khuôn là hỗn hợp DNA của 5 chủng này. Kết quả multiplex PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1% và được thể hiện trên hình 3.5 (B).
Kết quả trên hình 3.5 (B) cho thấy với nồng độ mồi femA là 0,5 µM và nồng độ các mồi là 0,3 µM, tất cả 5 gen đích của 5 chủng vi khuẩn đều được khuếch đại. Hơn nữa, ở nồng độ này, hỗn hợp sản phẩm PCR (đường chạy 6) đều xuất hiện cả 5 băng đặc hiệu tương ứng với 5 gen đích và không có sản phẩm phụ. Từ kết quả thu được, chúng tôi chọn nồng độ mồi femA là 0,5 µM
và nồng độ các mồi còn lại là 0,3 µM để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo.
3.3.2. Kết quả tối ƣu nhiệt độ gắn mồi của phản ứng multiplex PCR
Nhiệt độ gắn mồi là một trong các yếu tố ảnh hưởng lớn đến phản ứng PCR nhất là phản ứng multiplex PCR vì thành phần phản ứng này gồm nhiều cặp mồi và mỗi cặp mồi lại có nhiệt độ gắn mồi khác nhau. Do đó, nhiệt độ
gắn mồi phải được tối ưu để tránh các sản phẩm không đặc hiệu và đảm bảo các gen đích đã chọn đều được khuếch đại chính xác.
Việc tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi được thực hiện bằng cách chạy gradient nhiệt độ gắn mồi, nhiệt độ trung gian được chia tự động trên máy iCyler từ 52-59oC. Để tối ưu nhiệt độ gắn mồi, tiến hành lặp lại 3 lần, mỗi lần 4 phản ứng multiplex PCR giống nhau về thành phần, chỉ khác nhau về nhiệt độ gắn mồi (52oC, 55oC, 57oC và 59oC). Kết quả tối ưu nhiệt độ gắn mồi trong phản ứng multiplex PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1% và được thể hiện trên Hình 3.6.
Hình 3.6. Tối ƣu nhiệt độ gắn mồi cho phản ứng multiplex PCR
Hình ảnh điện di so sánh sản phẩm phản ứng multiplex PCR ở các nhiệt độ gắn mồi 52oC, 55oC, 57oC và 59oC. 1. Sản phẩm multiplex PCR (52oC), 2.sản phẩm multiplex PCR (55oC), 3.multiplex PCR (57oC), 4.multiplex PCR (59oC), 5.Thang DNA chuẩn 1kb.
Kết quả điện di trên Hình 3.6 cho thấy ở nhiệt độ gắn mồi 59oC (đường chạy 4), sản phẩm xuất hiện cả 5 băng đặc hiệu rõ nét tương ứng với 5 gen đích và không có sản phẩm phụ. Hơn nữa, cường độ của các băng sản phẩm multiplex PCR tại nhiệt độ 59oC sáng rõ nhất trong số các sản phẩm tại các
gen đích được khuếch đại. Như vậy, từ kết quả thu được, chúng tôi chọn nhiệt độ gắn mồi tối ưu là 59oC.
3.3.3. Kết quả lựa chọn Master Mix trong phản ứng multiplex PCR
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng Master Mix mua từ các hãng khác nhau để chuẩn bị phản ứng PCR. Thông thường, thành phần cơ bản của master Mix bao gồm buffer, dNTPs, MgCl2, Taq polymerase. Tuy nhiên,
dNTPs, MgCl2 và loại Taq polymerase của mỗi hãng có nồng độ khác nhau.
Hơn nữa, nồng độ của các thành phần này ảnh hưởng rất lớn đến độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng PCR. Do đó, chúng tôi khảo sát 3 loại Master Mix trong phản ứng multiplex PCR nhiều gen đích để lựa chọn Master Mix.
Để lựa chọn được loại Master Mix có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, tiến hành lặp lại 3 lần, mỗi lần thực hiện 3 phản ứng multiplex PCR nhiều gen đích khác nhau, mỗi phản ứng đều giống nhau về thành phần khuôn DNA, mồi, chỉ khác nhau về loại Master Mix. Kết quả lựa chọn loại Master mix được điện di kiểm tra trên gel agarose 1% và được thể hiện trên Hình 3.7.
Hình ảnh điện di so sánh sản phẩm phản ứng multiplex PCR với 3 loại Master Mix khác nhau.1: Sản phẩm multiplex PCR với Master Mix hãng Invitrogen, 2: Sản phẩm multiplex PCR với Master Mix hãng Promega, 3. Sản phẩm multiplex PCR với Master Mix hãng Bioline, 4. Marker 1kb.5, 6, 7. Đối chứng âm (không có khuôn DNA).
Kết quả điện di trên hình 3.7 cho thấy, với Mastermix hãng Invitrogen (đường chạy 1) và Mastermix hãng Promega (đường chạy 2), sản phẩm multiplex PCR chỉ xuất hiện 3 băng tương ứng với 3 gen đích gồm mdh (364 bp), oprL (504 bp) và gltA (722 bp). Trong khi đó, với Mastermix hãng
Bioline (đường chạy 3) thì sản phẩm multiplex PCR xuất hiện cả 5 băng đặc hiệu tương ứng với 5 gen đích và không có băng phụ. Kết quả này chứng tỏ Mastermix của hãng 3 có độ nhạy, độ đặc hiệu tốt và phù hợp với phản ứng multiplex PCR nhằm phát hiện được đồng thời nhiều gen quan tâm trong cùng một phản ứng. Các đường chạy 5, 6, 7 là các mẫu đối chứng âm tương ứng với 3 Mastermix của các hãng không có bất kỳ băng nào xuất hiện chứng tỏ hóa chất của chúng tôi có độ tinh sạch cao và quá trình thao tác thí nghiệm không bị nhiễm.
3.4. Kết quả thử nghiệm phƣơng pháp multiplex PCR trên các chủng nhiễm khuẩn thuần
Sau khi đã tối ưu được nhiệt độ gắn mồi và lựa chọn được loại Mastermix có độ nhạy cao, chúng tôi tiến hành thử nghiệm phản ứng multiplex PCR trên 30 chủng vi khuẩn nuôi cấy thuần gồm Staphylococcus
aureus (n=5), Acinetobacter baumannii (n=5), Escherichia coli (n=5),
Pseudomonas aeruginosa (n=5) và Klebsiella pneumonia (n=5),
Bảng 3.2. Kết quả thử nghiệm phản ứng multiplex PCR Chủng vi khuẩn Tổng số chủng Số chủng đƣợc xét nghiệm cho kết quả dƣơng tính
femA gltA phoA oprL md h Staphylococcus aureus 5 5 − − − − Acinetobacter baumannii 5 − 5 − − − Escherichia coli 5 − − 5 − − Pseudomonas aeruginosa 5 − − − 5 − Klebsiella pneumoniae 5 − − − − 5 Streptococcus suis 5 _ _ _ _ _ Tổng số 30 5 5 5 5 5
Kết quả thu được ở bảng 1 cho thấy 25 chủng chứa gen đích gồm
Staphylococcus aureus (n=5), Acinetobacter baumannii (n=5), Escherichia
coli (n=5), Pseudomonas aeruginosa (n=5), Klebsiella pneumoniae (n=5) cho
kết quả dương tính, chủng vi khuẩn còn lại Streptococcus suis (n=5) cho kết
quả âm tính. Điều này chứng tỏ phản ứng multiplex PCR đã tối ưu có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, có khả năng khuếch đại chính xác gen đích trong chủng vi khuẩn quan tâm. Trong trường hợp này, kĩ thuật multiplex PCR chứng tỏ được độ nhạy và độ đặc hiệu là 100% trong việc phát hiện đúng các chủng vi khuẩn. Dự đoán giá trị âm tính và dương tính của kĩ thật multiplex PCR là 100%.
3.5. Kết quả thử nghiệm phƣơng pháp multiplex PCR trên mẫu bệnh phẩm
3.5.1. Kết quả thử nghiệm phƣơng pháp multiplex PCR trên các mẫu bệnh phẩm cấy máu
Nhằm mục tiêu đưa phương pháp multiplex PCR áp dụng vào thực tiễn để chẩn đoán và phát hiện nhanh nhiễm khuẩn huyết, chúng tôi thử nghiệm phương này trên mẫu bệnh phẩm cấy máu trước. Phương pháp multiplex PCR được thử nghiệm trên 68 mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân nghi ngờ nhiễm khuẩn huyết nhận được từ bệnh viện Thanh Nhàn. Các mẫu này đã được mã hóa để tăng tính khách quan cho thử nghiệm.
Đầu tiên, DNA của các chủng vi khuẩn từ 68 mẫu bệnh phẩm cấy máu được tách chiết bằng phương pháp đun sôi (theo mô tả phần vật liệu và phương pháp nghiên cứu). Tiếp theo, chúng tôi dùng DNA đã tách chiết được để làm khuôn cho phản ứng multiplex PCR. Kết quả multiplex PCR được điện di triểm tra trên gel agarose 1% và so sánh với kết quả cấy máu.
Hình 3.8. Thử nghiệm phƣơng pháp multiplex PCR trên mẫu bệnh phẩm cấy máu.
Hình ảnh điện di sản phẩm multiplex PCR trên một số mẫu bệnh phẩm cấy máu. 1. Đối chứng âm, 2. Marker 1kb, 3-17. Sản phẩm multiplex PCR của các mẫu BN1-BN15.
Kết quả điện di kiểm tra trên gel agarose cho thấy sản phẩm PCR của các mẫu bệnh phẩm BN2 (đường chạy 4), BN4 (đường chạy 6), BN8 (đường chạy 10), BN10 (đường chạy 12), BN12 (đường chạy 14) cho kết quả dương tính với các băng sáng rõ tương ứng với kích thước của các gen đích gltA
(722 bp) của chủng Acinetobacter baumannii, mdh (364 bp) của chủng Klebsiella pneumonia, femA (296 bp) của chủng Staphylococcus aureus, phoA
(890 bp) của chủng Escherichia coli và oprL (504 bp) của chủng Pseudomonas aeruginosa. Các mẫu bệnh phẩm còn lại bao gồm BN1 (đường
chạy 3), BN3 (đường chạy 5), BN5 (đường chạy 7), BN6 (đường chạy 8), BN7 (đường chạy 9), BN9 (đường chạy 11), BN11 (đường chạy 13), BN13 (đường chạy 15), BN14 (đường chạy 16), BN15 (đường chạy 17) cho kết quả âm tính. Mẫu đối chứng (đường chạy 1) là đối chứng âm cho kết quả âm tính chứng tỏ hóa chất mà chúng tôi sử dụng có độ tinh khiết cao và quá trình thao tác thí nghiệm đảm bảo không bị nhiễm. Các mẫu bệnh phẩm âm tính có thể là các chủng vi khuẩn gây bệnh khác hoặc có thể chứa chủng vi khuẩn quan tâm mà gen đích không được khuếch đại hoặc không có bất kỳ chủng vi khuẩn nào. Ngoài ra, trong tổng số 68 mẫu bệnh phẩm cấy máu mà chúng tôi khảo sát còn có các mẫu dương tính và âm tính khác. Do đó, để kh ng định kết quả, chúng tôi tiến hành so sánh kết quả multiplex PCR của 68 mẫu cấy máu này với kết quả cấy máu để đánh khả năng phát hiện sinh vật đích bằng phương pháp multiplex PCR. Kết quả so sánh được thể hiện ở Bảng 3.3 dưới đây.
Bảng 3.3. So sánh kết quả multiplex PCR trên các mẫu bệnh phẩm cấy máu
với kết quả của phƣơng pháp cấy máu ST
T Mã bệnh nhân Kết quả multiple PCR Kết quả cấy máu
1 BN1 Âm tính Âm tính
2 BN2 Acinetobacter baumannii Acinetobacter baumannii
3 BN3 Âm tính Cầu khuẩn Gr (+)
4 BN4 Klebsiella pneumonia Klebsiella pneumonia
5 BN5 Âm tính Âm tính
6 BN6 Âm tính Âm tính
7 BN7 Âm tính Trực khuẩn Gr(+)
8 BN8 Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus
9 BN9 Âm tính Cầu khuẩn Gr (+)
10 BN10 Escherichia coli Escherichia coli
11 BN11 Âm tính Âm tính
12 BN12 Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas
aeruginosa
13 BN13 Âm tính Trực khuẩn Gr(-)
14 BN14 Âm tính Trực khuẩn Gr(-)
15 BN15 Âm tính Nấm candida Knisie
16 BN16 Âm tính Cầu khuẩn Gr (+)
17 BN17 Âm tính Cầu khuẩn Gr (+)
18 BN18 Âm tính Âm tính
19 BN19 Âm tính Cầu khuẩn Gr (+)
20 BN20 Âm tính Cầu khuẩn Gr (+)
ST
T Mã bệnh nhân Kết quả multiple PCR Kết quả cấy máu
22 BN22 Âm tính Âm tính
23 BN23 Âm tính Trực khuẩn Gr(-)
24 BN24 Âm tính Cầu khuẩn Gr (+)
25 BN25 Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus
26 BN26 Âm tính Cầu khuẩn Gr (+)
27 BN27 Âm tính Streptococus Pneumonie
28 BN28 Âm tính Cầu khuẩn Gr (+)
29 BN29 Âm tính Nấm candida Knisie
30 BN30 Âm tính Nấm candida Knisie
31 BN31 Escherichia coli Escherichia coli
32 BN32 Âm tính Cầu khuẩn Gr (+)
33 BN33 Âm tính Trực khuẩn Gr(-)
34 BN34 Âm tính Cầu khuẩn Gr (+)
35 BN35 Âm tính Âm tính
36 BN36 Âm tính Trực khuẩn Gr(-)
37 BN37 Âm tính Âm tính
38 BN38 Âm tính Streptococcus
Pneumonie
39 BN39 Âm tính Nấm candida Knisie
40 BN40 Âm tính Pseudomonas sp
41 BN41 Âm tính Cầu khuẩn Gr (+)
42 BN42 Âm tính Trực khuẩn Gr(-)
43 BN43 Âm tính Trực khuẩn Gr(+)
44 BN44 Âm tính Âm tính
ST
T Mã bệnh nhân Kết quả multiple PCR Kết quả cấy máu
46 BN46 Escherichia coli Escherichia coli
47 BN47 Escherichia coli Escherichia coli
48 BN48 Âm tính Cầu khuẩn Gr (+)
49 BN49 Escherichia coli Escherichia coli
50 BN50 Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus
51 BN51 Klebsiella pneumonia Klebsiella pneumonia
52 BN52 Escherichia coli Escherichia coli
53 BN53 Âm tính Tụ cầu da
54 BN54 Escherichia coli Escherichia coli
55 BN55 Âm tính Tụ cầu da