Thiết kế mồi đặc hiệu là một trong những yếu tố quyết định đến sự thành công của phản ứng multiplex PCR. Các lưu ý quan trọng khi thiết kế mồi cho phản ứng này được liệt kê bên dưới. Đây có thể coi là chìa khóa quyết định sự chính xác của quá trình khuếch đại các trình tự ADN với hàm lượng sản phẩm cao nhất.
* Chiều dài mồi
Phản ứng multiplex PCR chứa nhiều cặp mồi khác nhau, vì vậy nó đòi hỏi các mồi được thiết kế phải có chiều dài thích hợp. Thông thường các mồi có chiều dài khoảng từ 18 đến 22 nucleotide.
* Nhiệt độ nóng chảy của mồi (Tm)
Các mồi nên có nhiệt độ nóng chảy tương đương nhau, tốt nhất là nằm trong khoảng từ 55°C - 60°C. Với những trình tự có tỷ lệ GC cao, Tm của mồi có thể cao hơn (khoảng 75°C - 80°C). Độ dao động về Tm giữa các mồi nên nằm trong khoảng 3°- 5°C.
* Độ đặc hiệu
Độ đặc hiệu là vấn đề cần được quan tâm hàng đầu trong quá trình thiết kế mồi. Với phản ứng multiplex PCR nó càng trở nên quan trọng, đặc biệt là trong các phản ứng có xảy ra cạnh tranh về mồi và khuôn.
* Tránh hình thành dimer primer
Các mồi được thiết kế nên được kiểm tra xem chúng có hình thành dimer không. Dimer primer (hiện tượng mồi bắt cặp với nhau) có thể dẫn đến việc khuếch đại không đặc hiệu.
Tất cả các chỉ số cần lưu ý khi thiết kế mồi gần giống với thiết kế mồi cho 1 phản ứng PCR thông thường. Thông thường, khi tỷ lệ Mồi/Khuôn quá cao cũng có thể dẫn đến việc hình thành primer dimer, do đó phải chú ý chỉ số của các thành phần trong phản ứng.
* Thiết kế mồi cho phản ứng multiplex PCR bằng phần mền PrimerPlex
PrimerPlex là 1 công cụ hữu ích cho quá trình thiết kế mồi đối với phản ứng multiplex PCR. Chương trình này giúp kiểm tra các oligo xem chúng có phản ứng chéo với nhau hay không, đồng thời tăng sự thích ứng giữa các mồi. Quá trình này phân tích hàng triệu cặp mồi khả dĩ chỉ trong vài giây, sau đó chương trình đưa ra danh sách các mồi để người thiết kế lựa chọn.
1.4.4. Ƣu điểm của phƣơng pháp multiplex PCR
* Đối chứng nội kiểm (Internal control)
Vấn đề thường gặp trong phản ứng PCR đơn lẻ (Single PCR) là hiện tượng âm tính giả do sai về các thành phần hay chu trình nhiệt, cũng có khi lại là hiện tượng dương tính giả do bị nhiễm. Phương pháp multiplex PCR đã khắc phục được hiện tượng âm tính giả do mỗi sản phẩm khuếch đại sẽ cung cấp một giá trị giúp kiểm tra các phân đoạn được khuếch đại khác.
* Hiệu quả cao
so với một phản ứng PCR đơn lẻ. Các phản ứng multiplex PCR cũng bảo đảm được độ bền của enzyme polymerase và khuôn.
* Xác định được chất lượng khuôn
Phản ứng multiplex PCR có thể xác định được chất lượng mẫu (khuôn) hiệu quả hơn phản ứng PCR thông thường.
* Xác định được hàm lượng khuôn
Lũy thừa các số lượng bản sao và các tiêu chuẩn của phản ứng multiplex PCR có thể được sử dụng để ước lượng hàm lượng khuôn có trong mẫu. Để xác định được hàm lượng khuôn chính xác bằng phản ứng multiplex PCR cần phải có mẫu đối chiếu, số chu kỳ phản ứng và lượng tối thiểu chất ức chế phải được xác định sau mỗi mỗi chu kỳ khuếch đại.
Phản ứng multiplex PCR có thể ứng dụng trên cả khuôn là ARN sau khi chuỗi này được chuyển thành dạng cADN. Sợi cADN sẽ đóng vai trò làm khuôn cho phản ứng.
1.4.5. Tối ƣu hóa các thành phần cho phản ứng multiplex PCR
* Nồng độ mồi
Nồng độ mồi ban đầu cho phản ứng có nồng độ từ 0.1 µM đến 0.5 µM. Có thể điều chỉnh chỉ số này tùy thuộc vào từng điều kiện phản ứng, ví dụ, người ta có thể tăng hàm lượng mồi đối với các locus “yếu” và giảm nồng độ mồi với các locus “mạnh”. Nồng độ cuối cùng của mỗi mồi trong phản ứng nên nằm trong khoảng từ 0.04 µM đến 0.5 µM. Với số lượng bản sao thấp hay ADN phức tạp, nồng độ mồi nên nằm trong khoảng 0.3 µM đến 0.5 µM. Ngược lại nếu số lượng bản sao lớn hay ADN khuôn ít phức tạp thì nồng độ mồi nên nằm trong khoảng 0.04 µM đến 0.4 µM.
* Nồng độ dNTP và MgCl2
Nồng độ MgCl2 nên giữ cố định ở mức 2 mM. Nồng độ dNTP có thể dao động từ 0.5 mM đến 1.6 mM. Nồng độ thích hợp nhất của từng loại dNTP
là từ 0.2 mM đến 0.4 mM. Quá ngưỡng này sẽ làm giảm tốc độ phản ứng. Nồng độ mỗi loại dNTP thấp hơn 0.1 mM sẽ vẫn giữ được tốc độ phản ứng nhưng lại làm giảm số lượng sản phẩm. dNTP gốc (stock) nhạy cảm với quá trình rã đông, do đó làm hiệu quả phản ứng multiplex PCR có thể giảm. Để khắc phục nhược điểm này, dNTP nên được chia thành từng lượng nhỏ trước khi bảo quản ở -20ºC.
Do MgCl2 ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu quả hoạt động của enzyme Taq ADN polymerase nên nồng độ Mg2+ phải được kiểm tra chặt chẽ. Enzyme Taq polymerase, khuôn, dNTP và các mồi đều liên kết với MgCl2 nên nồng độ MgCl2 phụ thuộc vào nồng độ các thành phần này. Hơn nữa, nếu khuôn hoặc mồi có chứa EDTA hay EGTA thì nồng độ MgCl2 cũng sẽ được điều chỉnh. Mg2+ giúp ổn định cấu trúc sợi đôi, bảo vệ ADN khỏi bị biến tính. Nồng độ Mg2+ cao có thể dẫn đến việc làm tăng lượng sản phẩm không đặc hiệu do nó tác động đến quá trình gắn mồi lên sợi khuôn. Tuy nhiên nếu hàm lượng Mg2+ không đủ cũng sẽ làm giảm lượng sản phẩm cần thiết.
* Sự cân bằng dNTP/ MgCl2
Để làm việc hiệu quả, Taq ADN polymerase cần Mg tự do (bên cạnh Mg liên kết với dNTP và ADN). Đây là lí do tại sao khi tăng nồng độ dNTP thì tốc độ phản ứng PCR lại giảm trong khi đó tăng nồng độ Mg lại cho kết quả ngược lại. 0.2 mM dNTP kết hợp với 1.5 đến 2 mM MgCl2 là hợp lí. * Nồng độ dung dịch đệm (buffer)
Dùng đệm nồng độ 2X sẽ cải thiện hiệu quả của phản ứng multiplex PCR. Nó hiệu quả hơn bất kỳ chất điều chỉnh nào (như DMSO, glycerol, BSA). Các cặp mồi dùng để nhân các đoạn ADN có chiều dài lớn sẽ hoạt động tốt hơn ở nồng độ muối thấp trong khi các cặp mồi dùng để nhân các đoạn ADN ngắn hơn yêu cầu nồng độ muối cao hơn.
Khi lượng khuôn ADN thấp, hiệu quả khuếch đại và độ đặc hiệu của phản ứng có thể tăng lên nếu hạ thấp nhiệt độ gắn mồi. Người ta tiến hành thử nghiệm ở các nồng độ Taq ADN polymerase khác nhau, sau đó đưa ra được nồng độ tối ưu đối với enzyme này 2.5U/50µl dịch phản ứng. Nếu quá nhiều enzyme, nồng độ glycerol dùng để bảo quản enzyme có thể làm mất cân bằng quá trình khuếch đại làm tăng sự nhiễu. Tỷ lệ mồi đặc hiệu và hỗn hợp phụ thuộc vào hoạt tính của enzyme, các thành phần thiết yếu trong phản ứng như MgCl2, dNTPs và bản chất của ADN đích. Vì vậy, một loạt các cải tiến được thực hiện nhằm cải thiện quá trình PCR chủ yếu định hướng trực tiếp vào các yếu tố tác động đến việc gắn mồi và kéo dài chuỗi.
* Sử dụng các chất điều chỉnh: DMSO, Glycerol, BSA
Hầu hết các phản ứng multiplex PCR khó thực hiện đều phải được hỗ trợ bởi các chất phụ gia như DMSO, glycerol, formamide và betaine. Những phụ gia này giúp làm lỏng chuỗi ADN, do đó ADN dễ dàng bị biến tính bằng nhiệt nhanh hơn. Tuy nhiên, trong các phản ứng multiplex PCR, DMSO và glycerol lại gây ra sự cạnh tranh. Vì vậy, nồng độ của các chất này cũng nên được xem xét kiểm tra chặt chẽ. Nồng độ BSA đạt tới 0.8 µg/µl sẽ làm tăng hiệu quả phản ứng hơn nhiều so với việc bổ sung DMSO và glycerol.
1.4.6. Ứng dụng của phản ứng multiplex PCR
Multiplex PCR có nhiều ứng dụng rộng rãi, có thế xác định sự có mặt cùng lúc nhiều tác nhân khác nhau như virus, vi khuẩn và các tác nhân xâm nhiễm khác. Đồng thời, phản ứng multiplex PCR cũng được dùng để xác định các thành phần có trong một hỗn hợp mẫu hoặc cũng có thể dùng để xác định sự có mặt của nhiều gen đơn lẻ trong hệ gen.
Phản ứng multiplex PCR đƣợc sử dụng vào các mục đích: Xác định tác nhân gây bệnh; Hiệu suất SNP genotyping cao; Phát hiện đột biến; Phát hiện đột biến mất đoạn trong gen; Định lượng mẫu; Phân tích các liên kết; Phát
hiện ARN; Nghiên cứu pháp y…
1.4.7. Tình hình ứng dụng kỹ thuật PCR trong việc xác định các tác nhân nhiễm khuẩn huyết nhiễm khuẩn huyết
Hiện nay, khá nhiều các nhà khoa học đã tập trung phát triển kỹ thuật PCR, multiplex PCR, multiplex realtime PCR trong kiểm soát các tác nhân gây nhiễm khuẩn.
Anbazhagan D và tập thể (2011) phát triển các xét nghiệm PCR thông thường và multiplex realtime PCR để phát hiện mầm bệnh bệnh viện [7]. Gadsby NJ và tập thể (2016) dùng các kỹ thuật PCR xác định tác nhân gây bệnh đường hô hấp trong cộng đồng viêm phổi mắc phải [32]. Aydemir O và tập thể (2014) xác định vai trò của multiplex PCR xác định các vi khuẩn gây bệnh nhiễm khuẩn đường hô hấp dưới [13]. Ở Thổ Nhĩ Kỳ, Kurutepe S và tập thể (2012) điều tra nguyên nhân do vi khuẩn bằng phương pháp PCR thông thường và multiplex ở bệnh nhân người lớn bị viêm phổi cộng đồng [46]. Eser O.K. và tập thể (2012) so sánh phương pháp nuôi cấy và phương pháp realtime PCR trong việc phát hiện vi khuẩn Streptococcus pneumoniae và Haemophilus influenzae trong viêm tai giữa cấp mẫu vật tràn dịch [29]. Jbara
I và tập thể (2007). So sánh phương pháp nuôi cấy và các phương pháp PCR cho các phát hiện của Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae và Moraxella catarrhalis trong dịch não tủy và tràn dịch tai giữa [41]. Thong
K.L và tập thể (2011) đã xây dựng phản ứng multiplex PCR phát hiện đồng thời Staphylococcus aureus kháng methicillin, Acinetobacter baumannii,
Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae và Pseudomonas aeruginosa. Kết
quả khảo sát trên 50 mẫu kết quả dương tính và âm tính tương đồng 100% so với kết quả xác định bằng phương pháp nuôi cấy.
Ở Việt Nam, có một số nghiên cứu cũng như các nhà khoa học sử dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán các tác nhân gây nhiễm khuẩn huyết cũng như
nhiễm khuẩn bệnh viện: Nhóm nghiên cứu của PGS.TS. Lê Hữu Song, nhóm các bác sỹ ở Viện truyền nhiễm Trung ương, nhóm nghiên cứu thuộc bệnh viện Nhi Trung Ương, nhóm nghiên cứu thuộc bệnh viện Việt Đức, Bạch Mai, Thanh Nhàn,… Đa số các nghiên cứu sử dụng các Kit ngoại nhập hoặc các cặp mồi tham khảo trên tạp chí quốc tế ví dụ một nghiên cứu đăng trên tạp chí Y học thực hành của tác giả Phùng Thị Bích Thủy và tập thể đã sử dụng bộ Kit Real Time PCR đa mồi SeptiFast (Roche) trong chẩn đoán căn nguyên gây nhiễm trùng huyết ở trẻ em tại Bệnh viện Nhi Trung ương [5]. Nhóm nghiên cứu phát hiện được 43,3% dương tính trong khi phương pháp cấy máu truyền thống chỉ phát hiện được 3,3% tác nhân gây bệnh nhiễm trùng huyết. Các tác nhân nhiễm trùng huyết thường gặp nhất là Klebsiella pneumonia/oxytoca có tần số xuất hiện cao nhất ở 7 bệnh nhân (23,3%), tiếp
sau là Enterobacter cloacae/aerogenes với 2 trường hợp (6,6%), thêm vào đó là các vi khuẩn và nấm khác như: Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Candida parapsilosis, Aspergillus fumigatu, Candida albicans, Escherichia coli, Stenotrophomonas maltophilia.
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu
2.1.1. Hóa chất và sinh phẩm
Các chủng vi khuẩn: Staphylococcus aureus, Acinetobacter
baumannii, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae và
Pseudomonas aeruginosa phân lập từ máu bệnh nhân do bệnh
viện Thanh Nhàn cung cấp.
Các chủng nhiễm khuẩn huyết (nuôi cấy thuần).
Mẫu bệnh phẩm được lấy từ bình cấy máu của 68 bệnh nhân người Việt Nam nghi ngờ bị nhiễm khuẩn huyết được lấy từ Bệnh viện Thanh Nhàn.
Mẫu máu được lấy trực tiếp từ bệnh nhân nghi ngờ nhiễm khuẩn huyết do bệnh viện Thanh Nhàn cung cấp.
Các cặp mồi được tổng hợp bởi Proligo (Sigma-Aldrich, Corporation, USA) (Bảng 2.1)
Bảng 2.1. Trình tự Nucleotide của các cặp mồi
Cặp mồi Trình tự gltA Fw: 5’-ATTTACAGTGGCACATTAGGT-3’ Rv: 5’-GCAGAGATACCAGCAGAGAT-3’ phoA Fw: 5’-AAGCCCGGACACCATAAATGC-3’ Rv: 5’-TCATTACGTTGCGGATTTGGC-3’ oprL Fw: 5’-ATGGAATAGCTGAAATTCGG-3’ Rv: 5’-CTTCTTCAGCTCGACGCGA-3’ Mdh Fw: 5’-GCGTGGCGGTAGATCTAAGTCA-3’ Rv: 5’-TTCAGCTCCGCCACAAAGGTA-3’ femA Fw: 5’-CTCTTGCTGGTTTCTTCTTTATC-3’ Rv: 5’-GTGCGGTATATGCTGCGTAA-3’
Hóa chất: Mastermix, Tris-base, Tris-HCl, EDTA, SDS, EtBr, Agarose và các hóa chất khác do hãng Merck, Invitrogen, Promega, Bioline… cung cấp. Kit tách chiết DNA tổng số của hãng QIAgen (Đức).
2.1.2. Thiết bị
Các thiết bị được sử dụng thuộc phòng Công nghệ Tế bào Động vật và Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Gen, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam được mua từ nhiều hãng nổi tiếng khác nhau. Các thiết bị thường sử dụng như:
Máy Nanodrop 1000
Bộ điện di DNA của Bio- Rad, Hoa Kỳ
Bộ nguồn điện di PowerPac 300 (Bio-Rad, Hoa Kỳ).
Máy soi DNA (Mini -transllumminator. Bio-Rad, Hoa Kỳ). Máy ly tâm lạnh (Microcentrifuge-Sorvall, Mỹ).
Máy PCR (PCR system 9700, Applied Biosystem, Mỹ) Tủ lạnh 4oC, tủ lạnh sâu -20oC, -75oC (Sanyo, Nhật Bản) Máy ủ ổn nhiệt (Memmert, Đức)
Máy vortex (RotoLab, OSI) Máy khuấy từ (RotoLab, OSI) Lò vi sóng (Samsung)
Một số thiết bị khác như cân phân tích tủ sấy của hãng Carbolite (Anh), pipetman, nồi khử trùng,…
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
Để tiến hành đề tài này chúng tôi sử dụng hầu hết các kĩ thuật theo Sambrook và tập thể kèm theo các hướng dẫn của nhà sản xuất các bộ Kit, bên cạnh đó có cải biến cho phù hợp.
2.2.1. Thiết kế primer
Các gen đích gltA của chủng Acinetobacter baumannii, gen phoA của
chủng Escherichia coli, gen femA của chủng Staphylococcus aureus, gen mdh của chủng Klebsiella pneumoniae, gen oprL của chủng Pseudomonas aeruginosa được lựa chọn là gen đích trong nghiên cứu. Các primer được
thiết kế mới bằng phần mềm primer 3 plus, PrimerPlex, kiểm tra bằng công cụ BLAST (http://www.ncbi.nih.gov). Sau đó các cặp mồi đã được lựa chọn đó được kiểm tra bằng chương trình phần mềm insilico PCR (http://insilico.ehu.es/PCR/) dự đoán sản phẩm PCR (amplicon); kiểm tra bằng các phần mềm online (protocol-online.org).
2.2.2. Tách chiết DNA
2.2.2.1. Tách chiết DNA từ các chủng vi khuẩn nuôi cấy bằng Kit QIAgen
Các chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus, Acinetobacter baumannii,
Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae và Pseudomonas aeruginosa được
nuôi cấy trong môi trường đặc hiệu, thu tế bào và tiến hành tách chiết theo protocol của bộ Kit tách DNA tổng số từ vi khuẩn của QIAgen, thu lại DNA tổng số của vi khuẩn trong 50 µl nước khử ion vô trùng. Sản phẩm được điện di kiểm tra trên gel agarose và xác định hàm lượng bằng máy nanodrop 1000.
2.2.2.2. Tách chiết DNA từ mẫu bệnh phẩm cấy máu bằng phương pháp đun sôi
Bổ sung lysozyme nồng độ 1 mg/ml vào 1 ml mẫu bệnh phẩm cấy máu, ủ ở 37o trong 30 phút. Sau đó đun sôi mẫu ở 100oC trong 10 phút rồi làm lạnh nhanh trong nước đá 5 phút. Ly tâm mẫu với tốc độ 12.000 vòng/phút trong 5 phút để lấy dịch nổi (chứa DNA).
2.2.2.3. Tách chiết DNA từ mẫu máu của bệnh nhân nghi nhiễm khuẩn huyếtbằng kit tách DNA từ máu của QIAgen
DNA vi khuẩn trong mẫu máu của bệnh nhân được tách theo chỉ dẫn của kit Qiagen theo thứ tự các bước như sau:
- Hút 1 ml máu của bệnh nhân vào ống eppendorf 1,5 ml, ly tâm 7000 vòng /phút để thu tế bào.
- Hòa tan tế bào trong 180 µl đệm lysis chứa enzyme lysozyme 1 mg/ml và ủ ở 37oC trong 30 phút.
- Bổ sung 4 µl enzyme RNase 10 mg/ml, ủ mẫu ở nhiệt độ phòng
khoảng 5 phút.
- Bổ sung 200 µl EtOH (96-100%), đảo đều.
- Hút dịch lên cột, ly tâm cột 8000 vòng/phút, 1 phút, bỏ dịch qua cột.
- Bổ dung 500 µl dung dịch AW1 lên cột, ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch qua cột.
- Bổ sung 500 µl dung dịch AW2 lên cột, ly tâm 12 000 vòng/phút