đích
Tiếp theo, chúng tôi tiến hành phản ứng PCR đơn mồi với các cặp mồi đặc hiệu các gen đích tương ứng để xác định độ đặc hiệu. Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1% và được thể hiện trên Hình 3.2.
Kết quả điện di trên gel agarose cho thấy ở tất cả các giếng đều xuất hiện các băng đậm rõ nét có kích thước tương ứng khoảng 296 bp (đường chạy 1-3), 364 bp (đường chạy 4-6), 504 bp (đường chạy 7-9), 722 bp (đường chạy 10-12), 890 bp (đường chạy 13-15) phù hợp với tính toán lý thuyết về kích thước của các gen femA của chủng Staphylococcus aureus, mdh của
chủng Klebsiella pneumoniae, gen oprL của chủng Pseudomonas aeruginosa,
gltA của chủng Acinetobacter baumannii, và gen phoA của chủng Escherichia
coli. Kết quả PCR chứng tỏ tất cả các cặp mồi đã kiểm tra đều đặc hiệu với
các sinh vật đích vì các gen dự đoán đều được khuếch đại. Tuy nhiên để kh ng định chắc chắn các gen nhân bản được chính là các gen đích, sản phẩm PCR từ các chủng được lựa chọn tiến hành xác định trình tự.
Hình 3.2. Kiểm tra tính đặc hiệu của các cặp mồi và các gen đích của các chủng vi khuẩn gây nhiễm khuẩn huyết tƣơng ứng.
Cặp mồi phoA khuếch đại gen phoA (Escherichia coli), cặp mồi gltA khuếch
đại gen gltA (Acinetobacter baumannii), cặp mồi oprL khuếch đại gen oprL
(Pseudomonas aeruginosa), cặp mồi mdh khuếch đại gen mdh (Klebsiella
pneumonia), cặp mồi femA khuếch đại gen femA (Staphylococcus aureus).
Đường chạy 1-3: sản phẩm PCR gen femA (theo lý thuyết 296 bp), 4-6: sản
phẩm PCR gen mdh (theo lý thuyết là 364 bp), 7-9: sản phẩm PCR gen oprL (theo lý thuyết là 504 bp),: 10-12: sản phẩm PCR gen gltA (theo lý thuyết là 722 bp), 13-15: sản phẩm PCR gen phoA (theo lý thuyết là 890 bp), 16:
Marker 1 kb (Fermentas). 17: Đối chứng âm.
3.2.3. Kết quả xác định trình tự các sản phẩm PCR từ các chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus, Acinetobacter baumannii, Escherichia coli,
Klebsiella pneumoniae và Pseudomonas aeruginosa
Để kh ng định quá trình khuếch đại đã nhân được chính xác các gen đích, chúng tôi tiến hành phân tích trình tự DNA của các sản phẩm PCR với mồi tương ứng. Kết quả thu được được trình bày ở phần dưới đây.
> Trình tự gen oprL của Pseudomonas aeruginosa
1 atggaaatgc tgaaattcgg caaatttgct gcgctggctc tggccatggc 51 TGTAGCTGTG GGTTGCTCCT CCAAGGGCGG CGACGCTTCC GGTGAAGGTG 101 CCAACGGCGG CGTCGACCCG AACGCAGGCT ATGGCGCTAA CAGCGGTGCC 151 GTTGACGGCA GCCTGAGCGA CGAAGCCGCT CTGCGTGCGA TCACCACCTT 201 CTACTTCGAG TACGACAGCT CCGACCTGAA GCCGGAAGCC ATGCGTGCTC 251 TGGACGTACA TGCAAAAGAC CTGAAAGGCA GCGGTCAGCG CGTAGTCCTG 301 GAAGGCCACA CCGACGAACG TGGTACCCGC GAGTACAACA TGGCCCTGGG 351 CGAGCGTCGT GCCAAGGCCG TTCAGCGTTA CCTGGTACTG CAGGGCGTGT 401 CCCCGGCTCA GCTGGAACTG GTTTCCTACG GTAAGGAGCG TCCGGTTGCC 451 ACTGGCCACG ACGAGCAGTC CTGGGCCCAG AACCGTCGCG TCGAGCTGAA 501 GAAG
> Trình tự gen gltA của Acinetobacter baumannii
1 atttacagtg gcacattagg tcccgatgta atcgacgtta aagatgtatt 51 ggcctcaggt cactttacTT TTGATCCTGG TTTTATGGCG ACAGCTTCAT 101 GCGAGTCTAA AATCACATTT ATCGATGGTG ACAAAGGTAT TTTATTACAC 151 CGCGGTTACC CGATTGACCA GTTAGCGACT CAAGCAGACT ACCTTGAAAC 201 TTGTTATTTA TTATTAAATG GCGAGTTACC AACTGCTGAA CAAAAAGTTG 251 AGTTCGATGC GAAAGTTCGT GCTCATACTA TGGTTCATGA TCAAGTTAGC 301 CGTTTCTTCA ATGGTTTCCG TCGTGATGCT CACCCTATGG CAATCATGGT 351 TGGTGTAGTA GGCGCATTAT CTGCTTTCTA TCACAACAAC CTTGACATTG 401 AAGACATCAA CCACCGCGAA ATTACTGCGA TTCGTTTGAT TGCTAAAATT 451 CCAACGCTTG CTGCTTGGAG CTACAAATAT ACTGTAGGTC AGCCATTCAT 501 CTATCCACGT AATGACTTAA ATTACGCGGA AAACTTCTTA CACATGATGT 551 TTGCAACTCC TGCAGACCGT GACTACAAAG TAAACCCTGT TCTTGCTCGT 601 GCAATGGATC GTATCTTTAC GCTTCATGCT GACCACGAAC AAAACGCGTC 651 TACTTCTACA GTTCGACTTG CTGGTTCTAC TGGTGCGAAC CCATATGCGT 701 GTATCTCTGC TGGTATCTCT GC
> Trình tự gen phoA của Escherichia coli
1 aagcccggac accagaaatg cctgttctgg aaaaccgggc tgctcagagc 51 CGATATTACT GCACCCGGCG GTGCTCGCCG CTTAACGGGT GATCAGACCG 101 CTGCTCTGCG TGATTCTCTT AGCGATAAAC CTGCAAAAAA TATTATTTTG
151 CTGATTGGCG ATGGGATGGG GGACTCGGAA ATTACTGCCG CACGCAATTA 201 TGCCGAAGGT GCGGGCGGCT TTTTTAAAGG TATCGATGCC TTACCGCTTA 251 CCGGGCAATA CACTCACTAT GCGCTGAATA AAAAAACCGG CAAACCGGAC 301 TACGTCACCG ACTCGGCTGC ATCAGCAACC GCCTGGTCAA CTGGTGTCAA 351 AACCTATAAC GGCGCGCTGG GCGTCGATAT TCACGAAAAA GATCACCCAA 401 CGATTCTGGA AATGGCAAAA GCCGCAGGTC TGGCGACCGG TAACGTTTCT 451 ACCGCAGAGT TGCAGGATGC CACGCCCGCT GCGCTGGTGG CGCATGTGAC 501 CTCGCGCAAA TGCTACGGTC CAAGTGCGAC CAGTGAAAAA TGTCCGGGTA 551 ACGCTCTGGA AAAAGGCGGA AAAGGATCGA TTACCGAACA GCTGCTTAAC 601 GCCCGTGCCG ATGTTACGCT TGGCGGCGGT GCAAAAACCT TTGCTGAAAC 651 GGCAACCGCC GGTGAATGGC AGGGAAAAAC GCTGCGTGAA CAGGCACAGG 701 CGCGTGGTTA TCAGTTGGTG AGCGATGCTG CCTCACTGAA TTCGGTGACG 751 GAAGCGAATC AGCAAAAACC CCTATTAGGA CTGTTTGCTG ACGGCAATAT 801 GCCAGTGCGC TGGCAAGGAC CGAAAGCAAC GTACCACGGT AATATAGATA 851 AGCCCGCAGT CACCTGTACG CCAAATCCGC AACGTAATGA
> Trình tự gen mdh của Klebsiella pneumoniae
1 gcgtggcggt agatctaagt catatcccca cagatgtaaa aattaaagGA 51 TTTTCCGGTG AAGACGCTAC TCCGGCGCTG GAAGGCGCGG ATGTAGTGCT 101 GATCTCCGCG GGCGTGGCGC GTAAGCCCGG CATGGATCGT TCCGACCTGT 151 TTAATGTGAA TGCGGGTATC GTGAAGAACC TCGTGCAGCA GATTGCCAAA 201 ACCTGCCCGC AGGCCTGCAT CGGCATTATC ACCAACCCGG TGAATACCAC 251 CGTGGCTATC GCCGCCGAAG TACTGAAAAA AGCCGGCGTG TACGATAAAA 301 ACAAACTGTT CGGCGTTACC ACGCTGGACA TCATCCGTTC CAATACCTTT 351 GTGGCGGAGC TGAA
> Trình tự gen FemA của Staphylococcus aureus
1 CTCTGCTGGT TTCTTCTTTA TCAATCCATT TGAAGTTGTT TATTATGCTG 51 GTGGTACATC AAATGCATTC CGCCATTTTG CCGGAAGTTA TGCAGTGCAA 101 TGGGAAATGA TTAATTATGC ATTAAATCAT GGCATTGACC GTTATAATTT 151 CTATGGTGTT AGTGGTAAAT TTACAGAAGA TGCTGAAGAT GCTGGTGTAG 201 TTAAATTCAA AAAAGGTTAC AATGCTGAAA TTATTGAATA TGTTGGTGAC
Kết quả phân tích Blast cho thấy trình tự thu được có độ tương đồng cao từ 98% đến 100% với các trình tự của các chủng vi khuẩn tương ứng trên GenBank (phụ lục 1- 10). Như vậy các cặp primer đã thiết kế nhân bản được chính xác các gen đích của các vi khuẩn đích với đúng kích thước mong muốn: Gen phoA của Escherichia coli có kích thước 890 bp; gen GltA của
Acinetobacter baumannii có kích thước 722 bp; gen OprL của
Pseudomonas aeruginosa có kích thước 504 bp; gen Mdh của Klebsiella
pneumoniae có kích thước 364 bp; gen FemA của Staphylococcus aureus
có kích thước 296 bp.