1.3.3.1. Kỹ thuật PCR
PCR là kỹ thuật thường được áp dụng nhất cho các phát hiện của mầm bệnh từ cấy máu dương tính. Sử dụng xét nghiệm thương mại có sẵn hoặc broad-range PCR hoặc multiplex PCR.
Trong kỹ thuật PCR, phối hợp khả năng lai đặc hiệu của các đoạn DNA có trình tự bổ sung với gen đích cùng khả năng kéo dài chuỗi của DNA
polymerase để nhân bản các đoạn DNA khác nhau lên hàng triệu lần so với
ban đầu. Do DNA polymerase hoạt động theo nguyên tắc cần phức hợp khuôn-mồi, trong môi trường thích hợp có các dNTP thì sẽ kéo dài mồi thành sợi bổ sung với sợi khuôn. Vì vậy để nhân bản được đoạn DNA đích, người ta cần thiết kế các mồi (primer) đặc hiệu. Kỹ thuật PCR rất nhạy, chỉ cần một lượng nhỏ DNA khuôn (ở mức nanogam) là phản ứng đã có thể cho kết quả dương tính. Phương pháp này có độ nhạy cao, chính xác, phát hiện được nhiều tác nhân gây bệnh trong khoảng thời gian ngắn.
1.3.3.2. Kỹ thuật Mutiplex PCR
Các xét nghiệm multiplex PCR cho phép phát hiện nhanh chóng tác nhân gây bệnh trực tiếp từ máu. Mutiplex PCR khuếch đại nhiều DNA đích trong cùng một mẫu trong cùng một thời điểm sử dụng một hỗn hợp mồi. Kỹ thuật này thường được dựa trên sự khuếch đại DNA trong vùng sao chép của vi sinh vật. Đây là vùng không mã hóa của DNA có vị trí giữa các gen và có tính bảo thủ cao giúp phân biệt giữa các loài vi khuẩn, nấm và các loài sinh vật khác. Phương pháp có mức độ nhạy cao hơn khi sử dụng mồi thoái hóa [30].
Mặc dù kỹ thuật multiplex PCR phát hiện nhanh, nhạy các tác nhân gây bệnh so với cấy máu thông thường và có thể hỗ trợ rất lớn trong chẩn đoán nhưng không thể thay thế hoàn toàn phương pháp cấy máu. Trong nhiều nghiên cứu, tỷ lệ phát hiện bệnh do kết hợp của cả hai phương pháp cao hơn h n so với chỉ thực hiện PCR hoặc nuôi cấy máu riêng lẻ. Toàn bộ quá trình xét nghiệm bằng PCR đến khi cho kết quả có thể được hoàn thành trong khoảng 5 giờ. Phương pháp này rút ngắn thời gian cần thiết cho xác định kiểu hình và kháng sinh đồ đồng thời có ưu điểm là độ nhạy, độ đặc hiệu rất cao [70].
1.3.3.3. Kỹ thuật Broad-range PCR
Broad-range PCR cho phép phát hiện vi khuẩn hoặc nấm trong máu dựa trên gen mã cho 16S rRNA hoặc gen 23S rRNA của vi khuẩn và gen 18S rRNA của nấm. Sau phản ứng, các sản phẩm khuếch đại có thể được phát hiện bằng các phương pháp khác nhau như phân tích giải trình tự, pyrosequencing, hoặc lai với mẫu dò đặc hiệu [32].
1.3.3.4. Kỹ thuật Real-time PCR
Kỹ thuật real-time PCR cho phép phát hiện và định lượng sản phẩm khuếch đại khi tiến trình phản ứng đang diễn ra dựa trên cơ sở phản ứng huỳnh quang, trong đó sự tăng lên về số lượng DNA tương ứng với sự tăng lên của tín hiệu huỳnh quang. Tín hiệu huỳnh quang đo được phản ánh số lượng sản phẩm được khuếch đại trong mỗi chu kỳ. Tùy thuộc vào số lượng bản DNA đích ban đầu có trong ống phản ứng mà giá trị Ct (chu kỳ ngưỡng) của các mẫu là khác nhau. Dựa vào đặc điểm này có thể xác định số bản sao DNA đích có trong mẫu nghiên cứu dựa trên mẫu chuẩn đã biết rõ số lượng DNA đích ban đầu.
Real-time PCR là phương pháp nhanh hơn so với PCR truyền thống và không cần thao tác sau khuếch đại cho việc xác định vi khuẩn. Áp dụng các
phương pháp phân tử này đến nay đã được dùng trong việc phát hiện các loài vi khuẩn cụ thể từ các mô hoặc nhiễm trùng, như viêm màng não do vi khuẩn. Đối với các vi khuẩn nhiễm trùng bệnh viện, có rất nhiều nghiên cứu sử dụng realtime PCR để xác định các đối tượng này [67, 69].