CHƢƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.4. Xác định nồng độ DNA
Nồng độ DNA mạch kép được xác định bằng cách đo độ hấp thụ ở bước sóng 260 nm (OD260) và 280 nm (OD280).
Nồng độ DNA được tính theo công thức:
CDNA = OD260 × 50 × d
Trong đó: d: độ pha loãng mẫu khi đo CDNA: nồng độ DNA
Nếu 1,8 ˂ OD260/OD280 ˂ 2 thì mẫu DNA được đánh giá là đạt yêu cầu về mức độ tinh sạch cho các thí nghiệm sinh học phân tử tiếp theo.
2.2.5.Phƣơng pháp điện di DNA trên gel agarose
Chuẩn bị gel agarose 1%: cân 1 g agarose cho vào 100 ml dung dịch TAE 1X, đun trong lò vi sóng cho agarose tan hoàn toàn. Để nguội khoảng 50oC rồi rót dung dịch agarose vào khay điện di có cài sẵn răng lược. Sau khoảng 30 phút, khi gel đã đông, gỡ lược ra, đặt bản gel vào bể điện di. Rót đệm TAE 1X vào bể để dung dịch ngập cách mặt gel 5mm.
Tra mẫu DNA: Lấy mẫu DNA trộn với loading dye 6X rồi tra vào các giếng trên bản gel.
Chạy điện di ở điện thế 95 - 100V, trong thời gian khoảng 25 - 30 phút. DNA di chuyển từ cực âm đến cực dương. Quan sát sự di chuyển màu bromophenol blue để biết khi nào cần dừng điện di.
Soi gel: Bản gel được lấy nhẹ nhàng ra khỏi khay và ngâm vào dung dịch EtBr nồng độ 2µg/ml trong khoảng 5 phút rồi rửa lại bằng nước. Hiển thị kích thước DNA dưới ánh sáng đèn cực tím (UV) của máy soi
gel. Ước tính kích thước của DNA bằng cách đối chiếu với thang DNA chuẩn.
2.2.6. Phƣơng pháp PCR
2.2.6.1. Phương pháp PCR đơn mồi
Phản ứng PCR đơn mồi được dùng để kiểm tra hoạt động và độ đặc hiệu của mồi sau thiết kế. Các gen đích được khuếch đại bằng phản ứng PCR với các cặp mồi đặc hiệu.
Thành phần phản ứng: Mồi xuôi/ ngược : 1/1 µl Master Mix: 12.5 µl Temp: 3 µl H20: 7,5 µl Tổng 25 µl Chương trình chạy: 95oC: 3 phút 94oC: 45 giây 57oC: 45 giây 30 chu kỳ 72oC: 1 phút 72oC: 8 phút Giữ ở: 80C 2.2.6.2. Phương pháp multiplex PCR
Phản ứng multiplex PCR được thực hiện đồng thời với 5 cặp mồi nhân bản 5 gen đích của các chủng vi khuẩn. Tổng thể tích của phản ứng là 25 µl với thành phần và chương trình chạy như sau:
Thành phần phản ứng:
Mồi FemA, gltA, phoA, mdh,oprL Fw/Rv : 0.5 µl, 0.3 µl, 0.3 µl, 0.3 µl, 0.3 µl Master Mix: 12.5 µl Temp: 3 µl H20: 6.1 µl Tổng 25 µl Chương trình chạy: 95oC: 3 phút 94oC: 45 giây 59oC: 45 giây 30 chu kỳ 72oC: 1 phút 72oC: 8 phút Giữ ở: 80C
Phản ứng multiplex PCR được tối ưu với các điều kiện khác nhau về hàm lượng mồi, nhiệt độ bắt mồi, master mix… Với mỗi một yếu tố tối ưu sẽ giữ nguyên tất cả các thành phần, điều kiện còn lại chỉ thay đổi yếu tố cần tối ưu.
2.2.7. Phƣơng pháp giải trình tự gen
Sau khi thu được sản phẩm PCR đặc hiệu, chúng tôi tiến hành xác định trình tự sản phẩm PCR dựa trên phương pháp của F.Sanger và tập thể. Đặc trưng của phương pháp này là ngoài những nucleotide thông thường còn sử dụng thêm 4 loại dideoxynucleotide trong đó thay nhóm 3’-OH bằng 3’-H. Điều này khiến các dideoxynucleotide không còn khả năng hình thành liên kết photphodieste với các nucleotide tiếp theo, dẫn đến làm ngừng quá trình tổng hợp DNA.
Quy trình xác định trình tự gồm 3 bước:
Bước 1: Thực hiện phản ứng PCR với hỗn hợp thành phần phản ứng (15µl) bao gồm: 3 µl Bigdye, x µl sản phẩm PCR, 1,275 µl mồi, 3 µl đệm 2,5 X, bổ sung nước đến thể tích 15µl.
Chu trình nhiệt được thực hiện trên máy PCR 9700 (Applied Biosystem). Bước 1: 96oC, 1 phút, 1 chu kỳ. Bước 2: (96oC 10 giây, 50oC 5 giây, 60oC 4 phút), 25 chu kỳ.
Bước 2: Tinh sạch sản phẩm PCR
- Bổ sung 5 µl EDTA 12,5 mM, pH=8, ly tâm 4000 vòng/phút trong 45 giây.
- Bổ sung 60µl cồn 100%, ủ ở nhiệt độ phòng 15 phút. - Ly tâm 4500 vòng/phút trong 45 phút để thu tủa.
- Rửa tủa bằng cồn 70%. Ly tâm 10000 vòng/phút để thu tủa. - Làm khô tủa trong 3 phút.
- Hòa tan tủa trong 10 µl Hidiformamide. - Biến tính ở 95oC trong 3 phút.
Bước 3: Xác định trình tự trên máy. Sản phẩm PCR sau khi đã tinh sạch được đặt vào máy xác định trình tự tự động ABI 3100 Avant (Applied Biosystems) để đọc trình tự.
Trình tự thu được được xử lý bằng phần mềm Bioedit và công cụ Blast.
2.2.8. Đạo đức trong nghiên cứu
Tuân thủ theo các quy định trong Quy chế hoạt động của Hội đồng đạo đức trong nghiên cứu y sinh học ban hành kèm theo Quyết định số 5129/2002/QĐ - BYT ngày 19/12/2002 của Bộ trưởng Bộ Y tế.
Các bệnh nhân tham gia vào nghiên cứu đều được giải thích, được cung cấp thông tin đầy đủ trước khi tham gia nghiên cứu. Các bệnh nhân nghiên cứu (hoặc người thân của bệnh nhân) đều có quyền tự nguyện chấp thuận tham gia nghiên cứu, cũng như được quyền từ chối tham gia nghiên cứu bất kỳ lúc nào, với bất kỳ lý do gì.
Các kết quả nghiên cứu chỉ sử dụng vào mục đích phục vụ cho nghiên cứu này, không được sử dụng cho mục đích nào khác. Các thông tin cá nhân của bệnh nhân sẽ được đảm bảo bí mật. Không công bố tên của cá nhân bệnh nhân trên các bản công bố kết quả nghiên cứu (tạp chí khoa học, bài báo cáo Hội nghị khoa học...).
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả lựa chọn và thiết kế mồi đặc hiệu gen đích 3.1. Kết quả lựa chọn và thiết kế mồi đặc hiệu gen đích
Các chủng vi khuẩn gây nhiễm khuẩn huyết phổ biến Staphylococcus aureus, Acinetobacter baumannii, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae và
Pseudomonas aeruginosa được phòng Vi sinh vật bệnh viện Thanh Nhàn
phân lập từ bệnh nhân bằng phương pháp phân lập trên các môi trường thạch: thạch máu Columbia, thạch chocolate, môi trường Bromocresol purple, sử dụng máy cấy máu tự động batex với môi trường chai cấy ái khí của biomerieux. Định danh vi khuẩn bằng bộ định danh vi khuẩn API 20E của hãng Biomeieux (Pháp). Chúng tôi tiếp nhận các chủng này, sau đó tiến hành định danh thêm bằng phương pháp sinh học phân tử (phần kết quả này không trình bày ở đây) trước khi sử dụng cho các nghiên cứu về xây dựng phản ứng multiplex PCR xác định đồng thời 5 tác nhân gây bệnh nêu trên.
Gen phoA là một gen quản gia mã cho alkaline photphatase, phoA được một số nhà khoa học lựa chọn là đích để phát hiện Escherichia coli [43, 75].
PhoA cùng với các gen khác cũng được lựa chọn là gen đích để phát hiện
Escherichia coli bằng PCR đa mồi [77].
Staphylococcus aureus tổng hợp cầu nối peptidoglycan interpeptide
pentaglycine nhờ xúc tác của các peptidyl transferase FemX, FemA và FemB. Khi bất hoạt gen femA dẫn đến sự suy giảm peptidoglycan monoglycine là
một cơ chất của protein gắn penicilin (PBPs) cũng như làm cho thấp ái lực với tiểu phần PBP2a một sản phẩm được mã hóa bởi gen MecA và dẫn tới
giảm khả năng kháng kháng sinh. Do đó FemX hoặc FemA được xem như các gen đích tiềm năng trong việc phát hiện các chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus mới có tính kháng kháng sinh cao. Các sản phẩm do gen femA mã hóa
các chủng Staphylococcus aureus được phân lập. Trong số các sản phẩm do gen femA mã hóa có một protein 48 kDa từng được chỉ ra có liên quan trong quá trình chuyển hóa tế bào và được tìm thấy với số lượng lớn trong môi trường nuôi cấy [75].
Trong nghiên cứu này, gen femA của chủng Staphylococcus aureus
được nhân bản bằng cặp mồi femAR/F. Kích thước của sản phẩm PCR là 296 bp, tham khảo trình tự mồi của Mehrotra và tập thể (2000) [58].
Đối với chủng Acinetobacter baumannii, gen gltA là gen quản gia mã hóa cho enzyme tổng hợp citrate được chúng tôi lựa chọn là gen đích. GltA
được Bartual và tập thể (2005) lựa chọn để nghiên cứu [15]. Trong nghiên cứu này, các tác giả đã khuếch đại gen gltA cùng 6 gen quản gia khác là DNA gyrase subunit B (gyrB), glucose dehydrogenase B (gdhB), homologous recombination factor (recA), 60-kDa chaperonin (cpn60), glucose-6- phosphate isomerase (gpi), RNA polymerase 70 factor (rpoD), phospho- glucomutase (pgm), quinate shikimate dehydrogenase (quiA) và coenzyme A thiolase (pcaf). Trong 7 gen này GltA được xem như có tính bảo thủ cao và
phù hợp hơn các gen còn lại [15, 76].
Các protein liên kết màng của Pseudomonas aeruginosa đóng vai trò quan trọng trong sự tương tác của vi khuẩn với môi trường đồng thời cũng là một trong những nguyên nhân dẫn đến sự kháng kháng sinh hoặc có ảnh hưởng nhất định đến sự vận chuyển qua màng của tế bào. Daniel và tập thể (1997) đã khuếch đại 2 gen đặc trưng mã hóa cho lipoprotein bám màng là
oprI và oprL. Các nghiên cứu đều chỉ ra rằng oprL có tính bảo thủ rất cao
giữa các chủng Pseudomonas aeruginosa. Do đó gen oprL được lựa chọn làm gen đích để phát hiện Pseudomonas aeruginosa [25].
Thong và tập thể (2011) đã lựa chọn 6 gen TonB, infB, gyrB, mdh,
thử nghiệm được thường bị đột biến ở các loài khác nhau và thậm chí cả trong các chủng khác nhau của cùng một loài. Hơn nữa, trình tự của gen Parc là rất giàu C/G dẫn đến mồi thiết kế dễ tạo thành cấu trúc kẹp tóc hoặc dimer. Gen
23s-rRNA và Gen gyrB có số bản sao thấp trong hệ gen. Do đó gen mdh được
lựa chọn để phát hiện Klebsiella pneumoniae [76].
Như vậy, sau khi tham khảo các tài liệu, chúng tôi lựa chọn được các gen đích gltA cho chủng Acinetobacter baumannii, gen phoA là gen đích của chủng Escherichia coli, gen femA là gen đích của chủng Staphylococcus
aureus, gen mdh là gen đích của chủng Klebsiella pneumoniae, gen oprL lựa
chọn là gen đích của chủng Pseudomonas aeruginosa. Sựa lựa chọn này
tương đồng với nghiên cứu của Thong và tập thể (2011) [76]. Sau khi tham khảo trình tự các primer của các tác giả khác đã công bố, chỉnh sửa và thiết kế mới bằng phần mềm primer 3 plus, PrimerPlex, kiểm tra bằng công cụ BLAST (http://www.ncbi.nih.gov) để giảm thiểu khả năng nhân gen không đặc hiệu từ locut không phải là đích. Sau đó các cặp mồi đã được lựa chọn đó được kiểm tra bằng chương trình phần mềm insilico PCR (http://insilico.ehu.es/PCR/) dự đoán sản phẩm PCR (amplicon); kiểm tra bằng các phần mềm online (protocol-online.org). Chúng tôi đã lựa chọn và thiết kế được trình tự mồi được liệt kê ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Trình tự mồi và kích thƣớc sản phẩm PCR theo tính toán lý thuyết Tên mồi Trình tự Kích thƣớc sản phẩm gltA Fw: 5’ ATTTACAGTGGCACATTAGGT 3’ Rv: 5’ GCAGAGATACCAGCAGAGAT 3’ 722 bp phoA Fw: 5’ AAGCCCGGACACCATAAATGC 3’ 890 bp
Rv: 5’ TCATTACGTTGCGGATTTGGC 3’ Oprl Fw: 5’ ATGGAATAGCTGAAATTCGG 3’ Rv: 5’ CTTCTTCAGCTCGACGCGA 3’ 504 bp Mdh Fw: 5’ GCGTGGCGGTAGATCTAAGTCA 3’ Rv: 5’ TTCAGCTCCGCCACAAAGGTA 3’ 364 bp femA Fw: 5’ CTCTTGCTGGTTTCTTCTTTATC 3’ Rv: 5’ GTGCGGTATATGCTGCGTAA 3’ 296 bp
3.2. Kết quả kiểm tra các cặp mồi bằng thực nghiệm
3.2.1. Kiểm tra DNA tổng số tách chiết từ các chủng vi khuẩn
Các cặp primer sau khi thiết kế được đặt tổng hợp, tiến hành kiểm tra trên các mẫu DNA của các chủng chuẩn bệnh viện Thanh nhàn cung cấp. DNA tổng số của các chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus, Acinetobacter
baumannii, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae và Pseudomonas
aeruginosa được tách chiết như đã giới thiệu ở phần phương pháp và được
điện di kiểm tra trên gel agarose 1 % (Hình 3.1).
Hình 3.1. Điện di kiểm tra DNA tổng số của các chủng Staphylococcus
aureus, Acinetobacter baumannii, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae
Đường chạy 1-3:DNA tách chiết từ các chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus; 4-6: DNA tách chiết từ các chủng vi khuẩn Acinetobacter baumannii; 7-9; DNA tách chiết từ các chủng vi khuẩn Escherichia coli; 10- 12: DNA tách chiết từ các chủng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa; 13-15: DNA tách chiết từ các chủng vi khuẩn Klebsiella pneumoniae.
Kết quả điện di DNA tổng số cho thấy các băng DNA sáng rõ có độ di động thấp gần với vạch xuất phát và không bị phân cắt thành từng vệt chứng tỏ rằng DNA tổng tách được còn nguyên vẹn không bị đứt gãy, đạt hàm lượng và độ sạch cần thiết cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.2.2. Kết quả PCR kiểm tra từng cặp mồi đơn trên các chủng vi khuẩn đích đích
Tiếp theo, chúng tôi tiến hành phản ứng PCR đơn mồi với các cặp mồi đặc hiệu các gen đích tương ứng để xác định độ đặc hiệu. Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1% và được thể hiện trên Hình 3.2.
Kết quả điện di trên gel agarose cho thấy ở tất cả các giếng đều xuất hiện các băng đậm rõ nét có kích thước tương ứng khoảng 296 bp (đường chạy 1-3), 364 bp (đường chạy 4-6), 504 bp (đường chạy 7-9), 722 bp (đường chạy 10-12), 890 bp (đường chạy 13-15) phù hợp với tính toán lý thuyết về kích thước của các gen femA của chủng Staphylococcus aureus, mdh của
chủng Klebsiella pneumoniae, gen oprL của chủng Pseudomonas aeruginosa,
gltA của chủng Acinetobacter baumannii, và gen phoA của chủng Escherichia
coli. Kết quả PCR chứng tỏ tất cả các cặp mồi đã kiểm tra đều đặc hiệu với
các sinh vật đích vì các gen dự đoán đều được khuếch đại. Tuy nhiên để kh ng định chắc chắn các gen nhân bản được chính là các gen đích, sản phẩm PCR từ các chủng được lựa chọn tiến hành xác định trình tự.
Hình 3.2. Kiểm tra tính đặc hiệu của các cặp mồi và các gen đích của các chủng vi khuẩn gây nhiễm khuẩn huyết tƣơng ứng.
Cặp mồi phoA khuếch đại gen phoA (Escherichia coli), cặp mồi gltA khuếch
đại gen gltA (Acinetobacter baumannii), cặp mồi oprL khuếch đại gen oprL
(Pseudomonas aeruginosa), cặp mồi mdh khuếch đại gen mdh (Klebsiella
pneumonia), cặp mồi femA khuếch đại gen femA (Staphylococcus aureus).
Đường chạy 1-3: sản phẩm PCR gen femA (theo lý thuyết 296 bp), 4-6: sản
phẩm PCR gen mdh (theo lý thuyết là 364 bp), 7-9: sản phẩm PCR gen oprL (theo lý thuyết là 504 bp),: 10-12: sản phẩm PCR gen gltA (theo lý thuyết là 722 bp), 13-15: sản phẩm PCR gen phoA (theo lý thuyết là 890 bp), 16:
Marker 1 kb (Fermentas). 17: Đối chứng âm.
3.2.3. Kết quả xác định trình tự các sản phẩm PCR từ các chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus, Acinetobacter baumannii, Escherichia coli,
Klebsiella pneumoniae và Pseudomonas aeruginosa
Để kh ng định quá trình khuếch đại đã nhân được chính xác các gen đích, chúng tôi tiến hành phân tích trình tự DNA của các sản phẩm PCR với mồi tương ứng. Kết quả thu được được trình bày ở phần dưới đây.
> Trình tự gen oprL của Pseudomonas aeruginosa
1 atggaaatgc tgaaattcgg caaatttgct gcgctggctc tggccatggc 51 TGTAGCTGTG GGTTGCTCCT CCAAGGGCGG CGACGCTTCC GGTGAAGGTG 101 CCAACGGCGG CGTCGACCCG AACGCAGGCT ATGGCGCTAA CAGCGGTGCC 151 GTTGACGGCA GCCTGAGCGA CGAAGCCGCT CTGCGTGCGA TCACCACCTT 201 CTACTTCGAG TACGACAGCT CCGACCTGAA GCCGGAAGCC ATGCGTGCTC 251 TGGACGTACA TGCAAAAGAC CTGAAAGGCA GCGGTCAGCG CGTAGTCCTG 301 GAAGGCCACA CCGACGAACG TGGTACCCGC GAGTACAACA TGGCCCTGGG 351 CGAGCGTCGT GCCAAGGCCG TTCAGCGTTA CCTGGTACTG CAGGGCGTGT 401 CCCCGGCTCA GCTGGAACTG GTTTCCTACG GTAAGGAGCG TCCGGTTGCC 451 ACTGGCCACG ACGAGCAGTC CTGGGCCCAG AACCGTCGCG TCGAGCTGAA 501 GAAG
> Trình tự gen gltA của Acinetobacter baumannii
1 atttacagtg gcacattagg tcccgatgta atcgacgtta aagatgtatt 51 ggcctcaggt cactttacTT TTGATCCTGG TTTTATGGCG ACAGCTTCAT 101 GCGAGTCTAA AATCACATTT ATCGATGGTG ACAAAGGTAT TTTATTACAC 151 CGCGGTTACC CGATTGACCA GTTAGCGACT CAAGCAGACT ACCTTGAAAC 201 TTGTTATTTA TTATTAAATG GCGAGTTACC AACTGCTGAA CAAAAAGTTG 251 AGTTCGATGC GAAAGTTCGT GCTCATACTA TGGTTCATGA TCAAGTTAGC 301 CGTTTCTTCA ATGGTTTCCG TCGTGATGCT CACCCTATGG CAATCATGGT 351 TGGTGTAGTA GGCGCATTAT CTGCTTTCTA TCACAACAAC CTTGACATTG 401 AAGACATCAA CCACCGCGAA ATTACTGCGA TTCGTTTGAT TGCTAAAATT 451 CCAACGCTTG CTGCTTGGAG CTACAAATAT ACTGTAGGTC AGCCATTCAT 501 CTATCCACGT AATGACTTAA ATTACGCGGA AAACTTCTTA CACATGATGT 551 TTGCAACTCC TGCAGACCGT GACTACAAAG TAAACCCTGT TCTTGCTCGT 601 GCAATGGATC GTATCTTTAC GCTTCATGCT GACCACGAAC AAAACGCGTC 651 TACTTCTACA GTTCGACTTG CTGGTTCTAC TGGTGCGAAC CCATATGCGT 701 GTATCTCTGC TGGTATCTCT GC
> Trình tự gen phoA của Escherichia coli
1 aagcccggac accagaaatg cctgttctgg aaaaccgggc tgctcagagc 51 CGATATTACT GCACCCGGCG GTGCTCGCCG CTTAACGGGT GATCAGACCG 101 CTGCTCTGCG TGATTCTCTT AGCGATAAAC CTGCAAAAAA TATTATTTTG
151 CTGATTGGCG ATGGGATGGG GGACTCGGAA ATTACTGCCG CACGCAATTA 201 TGCCGAAGGT GCGGGCGGCT TTTTTAAAGG TATCGATGCC TTACCGCTTA 251 CCGGGCAATA CACTCACTAT GCGCTGAATA AAAAAACCGG CAAACCGGAC 301 TACGTCACCG ACTCGGCTGC ATCAGCAACC GCCTGGTCAA CTGGTGTCAA 351 AACCTATAAC GGCGCGCTGG GCGTCGATAT TCACGAAAAA GATCACCCAA 401 CGATTCTGGA AATGGCAAAA GCCGCAGGTC TGGCGACCGG TAACGTTTCT 451 ACCGCAGAGT TGCAGGATGC CACGCCCGCT GCGCTGGTGG CGCATGTGAC 501 CTCGCGCAAA TGCTACGGTC CAAGTGCGAC CAGTGAAAAA TGTCCGGGTA 551 ACGCTCTGGA AAAAGGCGGA AAAGGATCGA TTACCGAACA GCTGCTTAAC 601 GCCCGTGCCG ATGTTACGCT TGGCGGCGGT GCAAAAACCT TTGCTGAAAC 651 GGCAACCGCC GGTGAATGGC AGGGAAAAAC GCTGCGTGAA CAGGCACAGG 701 CGCGTGGTTA TCAGTTGGTG AGCGATGCTG CCTCACTGAA TTCGGTGACG 751 GAAGCGAATC AGCAAAAACC CCTATTAGGA CTGTTTGCTG ACGGCAATAT 801 GCCAGTGCGC TGGCAAGGAC CGAAAGCAAC GTACCACGGT AATATAGATA 851 AGCCCGCAGT CACCTGTACG CCAAATCCGC AACGTAATGA
> Trình tự gen mdh của Klebsiella pneumoniae
1 gcgtggcggt agatctaagt catatcccca cagatgtaaa aattaaagGA 51 TTTTCCGGTG AAGACGCTAC TCCGGCGCTG GAAGGCGCGG ATGTAGTGCT 101 GATCTCCGCG GGCGTGGCGC GTAAGCCCGG CATGGATCGT TCCGACCTGT 151 TTAATGTGAA TGCGGGTATC GTGAAGAACC TCGTGCAGCA GATTGCCAAA