5. Tính mới của đề tài
1.3.1. Cơ sở khoa học của sự phát sinh phôi vô tính
Phôi vô tính/phôi soma/phôi sinh dưỡng (somatic embryogenis) đều là khái niệm mô tả một cấu trúc lưỡng cực gồm cực chồi và cực rễ, bắt nguồn từ tế bào sinh dưỡng hay tế bào soma, dưới những điều kiện thích hợp sẽ phát triển thành một cơ thể có chức năng hoàn chỉnh. Quá trình hình thành phôi vô tính trải qua các giai đoạn tương tự như phát sinh phôi hợp tử, trải qua các giai đoạn phôi hình cầu, hình trái tim, dạng thủy lôi và giai đoạn lá mầm, và sau đó phát triển thành cây con hoàn chỉnh. Trong quá trình phát triển phôi vô tính, các giai đoạn hình thái không có kết nối với mô mạch [65]. Phôi vô tính rất giống phôi hữu tính về mặt hình thái, quá trình phát triển cũng như về mặt sinh lý nhưng không phải là sản phẩm của sự thụ tinh giữa giao tử đực và giao tử cái, không có quá trình tái tổ hợp di truyền, các phôi vô tính mang thông tin di truyền giống hệt tế bào soma đã sinh ra nó. Phôi vô tính có thể được hình thành từ một tế bào đơn hay từ cả một cụm tế bào. Thông qua một quá trình phân chia có thứ tự phôi diễn ra sự biệt hóa, trưởng thành và phát triển thành cây con [66].
Quá trình phát sinh phôi vô tính đại diện cho mô hình toàn thế hoàn chỉnh, liên quan đến hoạt động của các tín hiệu phức tạp, cũng như việc lập trình lại sự biểu hiện gen được điều chỉnh cụ thể. Sự điều hòa này đáp ứng với các kích thích ngoại sinh được tạo ra do các chất ĐHST thực vật [65]. Cảm ứng phát sinh phôi vô tính có tính năng kích hoạt lại chu kỳ tế bào trong các tế bào thực vật đã được biệt hóa, dưới tác động của các kích thích bên ngoài. Từ đó, mở ra con đường chuyển từ loại tế bào soma sang loại tế bào sinh phôi [67]. Các kích thích này khởi động chương trình di truyền dẫn đến thiết lập các dòng tế bào có kiểu gen phiên mã bị thay đổi, đầu tiên là sự hình thành cấu trúc không đối xứng đỉnh – đáy. Phôi vô tính trưởng thành giống
phôi hợp tử đều thể hiện đỉnh – đáy và phân cực hướng tâm, có chồi sơ cấp và mô phân sinh rễ, chứa các cơ quan phôi điển hình, lá mầm, rễ mầm [66] .
Tế bào thực vật có tính toàn thế do vậy có thể tái tạo thành cây hoàn chỉnh thông qua con đường phát sinh phôi vô tính (nhờ vai trò quan trọng của auxin và cytokinin, ABA, các stress,..) hoặc/và con đường phát sinh cơ quan. Theo Von Arnold và cộng sự (2002), sự phát sinh phôi vô tính được xác định là quá trình hình thành cấu trúc có hai cực chồi và rễ tương tự như phôi hợp tử, mỗi cực đều có mô phân sinh và hệ thống tiền mạch (provascular) phân biệt với hệ mạch ở thể chồi/cụm chồi tái sinh theo con đường phát sinh cơ quan. Phôi vô tính hình thành và phát triển từ tế bào sinh dưỡng, có thể tái sinh trực tiếp từ mô nuôi cấy mà không qua giai đoạn trung gian là mô sẹo hoặc/và tái sinh từ mô sẹo (tái sinh gián tiếp)
[68]. Theo tài liệu, ở tạo phôi vô tính trực tiếp, phôi có nguồn gốc từ tế bào PEDC
(Pre-Embryogenic Determined Cell) – tế bào được xác định có khả năng tạo phôi; ở tạo phôi gián tiếp, phôi hình thành từ tế bào IECD (Induced Embryogenic Determined Cell) – tế bào được xác định có khả năng tạo phôi thông qua cảm ứng.
Ở tạo phôi trực tiếp, theo một số tài liệu, ghi nhận có các bước tạo phôi vô tính cơ bản như: (1) Khởi tạo loại tế bào có khả năng sinh phôi từ một số loại tế bào khác nhau ở mô cấy ban đầu như tế bào biểu bì/dưới biểu bì hoặc tế bào ở/gần vùng hệ mạch dưới tác động của auxin (có hoặc không có cytokinin) ngoại sinh, tác nhân tạo áp suất thẩm thấu cao,..; (2) Khởi tạo phôi với các giai đoạn phát triển khác nhau, và
(3) Phôi phát triển với hệ mạch độc lập với mô mẹ.
Ở tạo phôi gián tiếp, theo Von Arnold và cộng sự (2002), có 5 bước từ lúc tạo vật liệu tế bào có khả năng sinh phôi đến giai đoạn nhận được cây hoàn chỉnh, là (1) Tạo được vật liệu tế bào có khả năng sinh phôi từ nuôi cấy vật liệu ban đầu (như mảnh lá,..) trên môi trường có auxin (có hoặc không có cytokinin); (2) Nuôi cấy nhân sinh khối tế bào có khả năng sinh phôi trên môi trường đặc hoặc trong môi trường lỏng với chất ĐHST như trên; (3) Nuôi cấy ‘tiền trưởng thành’ phôi ở môi trường không có chất ĐHST, điều này ức chế sự tiếp tục tăng sinh khối và kích thích sự hình thành và phát triển phôi ở giai đoạn ban đầu; (4) Tạo phôi trưởng thành qua nuôi cấy trên môi trường có ABA hoặc/và có áp suất thẩm thấu giảm; (5) Tạo cây con qua nuôi cấy trên môi trường không có chất ĐHST [68].
Đến nay, quá trình và cơ chế sinh phôi ở thực vật mô hình Arabidopsis đã được chỉ rõ. Ở tạo phôi trực tiếp, tế bào xác định đi vào con đường tạo phôi chỉ một thời gian ngắn sau bước tái lập trình di truyền, không cần trải qua phân bào trước; ngược lại, ở tạo phôi gián tiếp, khả năng sinh phôi (embryogenic competence) vẫn giữ ở mức tương đối sau giai đoạn tạo mô sẹo [69].
Phương pháp tạo phôi vô tính trực tiếp có nhiều ưu điểm so với tạo phôi vô tính gián tiếp:
Do không thông qua giai đoạn nuôi cấy tạo mô sẹo, hơn nữa phôi hình thành trên bề mặt mô cấy do vậy hiện tượng tái lập trình (reprogramming) về mặt di truyền
ở mức tối thiểu, lại hình thành trong thời gian tương đối ngắn [68], nên phôi tái sinh ít bị biến dị, do vậy có tiềm năng ứng dụng cao thể phôi này đặc biệt trong trong nghiên cứu nhân giống, bảo quản lạnh phôi và biến nạp gen,... Tạo phôi trực tiếp đơn
giản hơn trong kỹ thuật nuôi cấy; ngược lại quá trình tái sinh phôi gián tiếp trải qua các bước cảm ứng và tăng sinh mô sẹo tạo phôi, phải lập trình lại nên đòi hỏi dài về mặt thời gian, vì vậy, cơ chế điều hòa và cảm ứng phức tạp hơn so với sự hình thành phôi vô tính trực tiếp. Mức độ phụ thuộc vào chất ĐHST khác nhau giữa tạo phôi trực tiếp và gián tiếp [70].
Có thể nhân sinh khối phôi thông qua cơ chế tạo phôi thứ cấp bằng phương pháp nuôi lỏng lắc và phương pháp dùng bioreactor dùng cho nhiều mục đích khác nhau đặc biệt cho nghiên cứu thu nhận hợp chất thứ cấp.