5. Tính mới của đề tài
2.3.1.1. Ảnh hưởng của auxin (NAA/IBA) và môi trường khoáng đến sự tạo phôi trực tiếp
2.3.1.1. Ảnh hưởng của auxin (NAA/IBA) và môi trường khoáng đến sự tạo phôitrực tiếp từ mô lá trực tiếp từ mô lá
Để khảo sát ảnh hưởng riêng rẽ của loại auxin với nồng độ thích hợp và môi trường khoáng đến sự phát sinh phôi trực tiếp từ mảnh lá, tiến hành bố trí thí nghiệm theo kiểu hai yếu tố: yếu tố chất ĐHST với các mức nồng độ khác nhau; yếu tố về môi trường khoáng với 4 loại môi trường.
Vật liệu nuôi cấy: mảnh lá kích thước 10 x 10 mm.
Môi trường nuôi cấy là ½MS, MS [105], B5 [106] và SH [107] bổ sung loại auxin riêng lẻ (NAA hoặc IBA) ở các nồng độ khác nhau (0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 mg/L), có chứa 30 g/L đường (sucrose). Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, tiến hành cấy 5 mẫu/đĩa, 6 đĩa/lần lặp lại, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Ghi nhận các chỉ tiêu về tỷ lệ mẫu tạo phôi (%); số phôi/mẫu tạo phôi tại thời điểm 60 NSC.
Quan sát cấu trúc giải phẫu phôi
Cắt dọc phôi (cầu, trái tim, thủy lôi) thành lát mỏng bằng dao lam, ngâm vi phẫu vào nước javel đến khi mẫu trắng (loại bỏ nội chất tế bào), rửa sạch mẫu bằng nước cất. Sau đó, ngâm vi phẫu trong dung dịch acid acetic 10% trong 10 phút (loại bỏ javel trước khi nhuộm). Thực hiện nhuộm kép vi phẫu bằng thuốc nhuộm son phèn
- lục iod trong 15 phút, rửa sạch mẫu [43]. Quan sát tiêu bản bằng kính hiển vi soi nổi Leica (vật kính 20X) và chụp hình.
Chỉ tiêu theo dõi: Các dạng hình thái của phôi vô tính (dạng phôi cầu, phôi tim, phôi thủy lôi, phôi dạng hai lá mầm)
Chỉ tiêu theo dõi: Các dạng hình thái của phôi vô tính (dạng phôi cầu, phôi tim, phôi thủy lôi, phôi dạng hai lá mầm)
Vật liệu nuôi cấy: mảnh lá kích thước 10 x 10 mm
Môi trường nuôi cấy là môi trường khoáng có loại auxin với các nồng độ có tác động tích cực đến sự hình thành phôi (kế thừa kết quả từ thí nghiệm 2.3.1.1) và có bổ sung BA với các nồng độ khác nhau (0; 0,25; 0,5; 1mg/L), 30 g/Lsucrose. Thí nghiệm bố trí theo kiểu hai yếu tố: yếu tố về nồng độ của loại auxin với các mức nồng độ tác động tích cực đến tạo phôi (kết quả thí nghiệm trên), yếu tố về nồng độ của