5. Tính mới của đề tài
3.1.1.1. Ảnh hưởng của auxin (NAA/IBA) và môi trường khoáng đến sự tạo phôi vô tính
3.1.1.1. Ảnh hưởng của auxin (NAA/IBA) và môi trường khoáng đến sự tạo phôivô tính trực tiếp từ mô lá vô tính trực tiếp từ mô lá
Hình 3.1. Các dạng phát triển của phôi vô tính hình thành trực tiếp từ mô lá.
A,B. Phôi cầu đơn, cụm phôi cầu; C. Phôi dạng tim (1) và dạng cầu (2); D. Phôi dạng thủy lôi; E,F,G,H. Phôi có lá mầm và rễ mầm phát triển; I. Cây con hoàn chỉnh lá mầm, lá thật (đơn, kép), rễ cọc điển hình. Mũi tên chỉ lá mầm (trắng), rễ mầm (đen). Thanh ngang 2 mm.
Sau 5 tuần nuôi cấy, phôi vô tính xuất hiện ở nhiều nghiệm thức, ở môi trường SH có bổ sung 5 mg/L NAA phôi xuất hiện sớm và nhiều nhất, môi trường ½MS phôi phát sinh chậm, ít hơn. Sự phân hóa cấu trúc trong quá trình phát sinh phôi từ mảnh lá NGBCC bắt đầu từ dạng phôi cầu, xuất hiện khoảng 32 – 35 NSC, có màu vàng nhạt (Hình 3.1A), giai đoạn phôi hình tim có màu xanh, xuất hiện sau đó khoảng 10 ngày, đây là dấu hiệu tiền hai lá mầm, dạng đặc trưng của sự hình thành phôi ở cây hai lá mầm (Hình 3.1C). Dạng phôi thủy lôi (Hình 3.1D) phát triển tiếp đến giai đoạn có hai lá mầm khoảng 15 – 20 ngày tiếp theo (Hình 3.1E,F,G,H). Phôi phát sinh trực
tiếp từ mảnh lá NGBCC đã trải qua tuần tự 04 dạng phát triển của phôi.
Quan sát sự phát sinh phôi từ mảnh lá NGBCC nhận thấy, các hình dạng khác nhau và các giai đoạn phát triển của phôi cùng xuất hiện trên cùng mẫu cấy (Hình 3.1C1,C2), điều đó chứng tỏ quá trình phát sinh phôi không đồng bộ và các tế bào khi đủ điều kiện sẽ phát sinh phôi.
Sau 60 ngày nuôi cấy, ở môi trường không bổ sung NAA/IBA, các mẫu cấy đều không phát sinh hình thái, không xuất hiện phôi, mẫu cấy hóa nâu và chết sau đó, điều đó chứng tỏ lượng chất ĐHST nội sinh ít không đủ cảm ứng phát sinh phôi. Tất cả các mẫu cấy trên môi trường ½MS, MS, B5, SH có bổ sung IBA (1; 2; 3; 4; 5; 6 mg/L), đều không ghi nhận được cấu trúc phôi xuất hiện trong suốt 60 ngày nuôi cấy (không trình bày số liệu). Ngược lại, các nghiệm thức bổ sung NAA (1; 2; 3; 4; 5; 6 mg/L) vào môi trường nuôi cấy đều có cảm ứng tạo phôi vô tính theo hướng tích cực (Hình 3.2). Điều đó chứng tỏ, sự cảm ứng tạo phôi của mảnh lá NGBCC đối với mỗi loại auxin trong môi trường nuôi cấy là khác nhau và cần có loại auxin ngoại sinh thích hợp là NAA, còn IBA hoàn toàn không thích hợp cho sự cảm ứng tạo phôi.
Kết quả (Bảng 3.1) cho thấy, tỷ lệ mẫu tạo phôi và số phôi/mẫu tăng khi tăng nồng độ NAA (1 – 5 mg/L) trong môi trường nuôi cấy, khi tăng nồng độ 6 mg/L NAA thì tỷ lệ mẫu tạo phôi và số phôi/mẫu đều giảm. Khi xét các mức nồng độ NAA và các loại môi trường khoáng, nhận thấy môi trường ½MS có bổ sung 1 mg/L NAA có tỷ lệ mẫu tạo phôi (%) và số phôi/mẫu thấp nhất (24,44% và 6,18 phôi/mẫu). Các chỉ tiêu này đạt giá trị cao nhất khi môi trường SH có bổ sung 5 mg/L NAA với tỷ lệ mẫu tạo phôi 88,89% và 19,95 phôi/mẫu (Hình 3.2L). Kết quả này có ý nghĩa khác biệt về thống kê so với tất cả các nghiệm thức còn lại. Điều đó chứng tỏ, tỷ lệ mẫu tạo phôi
( và số phôi/mẫu chịu ảnh hưởng bởi các mức nồng độ của loại auxin thích hợp (NAA) và loại môi trường khoáng phù hợp. Như vậy, nồng độ 5 mg/L NAA là tối ưu để kích thích tạo phôi đạt hiệu quả cao nhất từ mảnh lá NGBCC, trong môi trường nuôi cấy có hàm lượng và thành phần khoáng thích hợp là SH.
Sự cảm ứng phát sinh phôi từ mô lá NGBCC chỉ ở những nghiệm thức có bổ sung NAA, số phôi phát sinh ít hoặc nhiều tùy thuộc nồng độ NAA sử dụng, điều này cho thấy vai trò của auxin ngoại sinh là mang tính quyết định. Qua vết thương của mẫu cấy làm tăng sự hấp thụ auxin ngoại sinh, sự hiện diện của auxin ngoại sinh
(NAA) trong tế bào làm tăng IAA nội sinh thông qua quá trình tổng hợp IAA nội
sinh, sự gia tăng của IAA nội sinh không thể thiếu để thay đổi chương trình di truyền dẫn đến phát sinh phôi, sự cân bằng nội môi của các auxin rất quan trọng cho cảm ứng tạo phôi [90]. Sự khác nhau về loại và nồng độ auxin ngoại sinh áp dụng trong mối tương tác với sinh tổng hợp auxin nội sinh có vai trò quan trọng trong phát sinh phôi vô tính [88][89]. Vai trò của auxin ngoại sinh và sự vận chuyển phân cực của auxin, đóng vai trò quan trọng trong sự phát sinh phôi vô tính, điều này được Verma và cộng sự (2018) chứng minh trong nghiên cứu tác động của auxin ngoại sinh đến phát sinh phôi vô tính trực tiếp của Digitalis trojana[14].
Như vậy, auxin trong đó có NAA là yếu tố truyền tín hiệu cảm ứng phát sinh phôi, có vai trò quan trọng kênh thông tin tế bào - làm tế bào biến đổi đến trạng thái cuối cùng đã được chương trình hóa là phát sinh phôi vô tính [65]. Tuy nhiên khả năng đáp ứng tạo phôi của mô thực vật khác nhau đối với các loại auxin trong môi trường là khác nhau [70].
Môi trường nuôi cấy là một trong những yếu tố quan trọng nhất trong nuôi cấy in vitro, chứa thành phần và hàm lượng các chất khoáng cần thiết cho sự phát sinh phôi. Trong thí nghiệm này, sử dụng các môi trường khoáng thường sử dụng trong nghiên cứu phát sinh phôi vô tính ở họ Ngũ gia bì là MS, B5, SH [72][71][38] và ½MS. Kết quả sau 60 ngày nuôi cấy, phôi phát sinh cao nhất ở môi trường SH và thấp nhất ở môi trường ½MS, điều đó chứng tỏ thành phần và hàm lượng chất khoáng có tác động đến sự phát sinh phôi và môi trường khoáng SH thích hợp nhất cho cảm ứng tạo phôi trực tiếp từ mô lá NGBCC.
Như vậy, hiệu quả phát sinh phôi chịu ảnh hưởng bởi loại, nồng độ auxin thích hợp, hàm lượng và thành phần khoáng của môi trường nuôi cấy, trong đó auxin có vai trò quyết định. Trong nghiên cứu này, tỷ lệ % mẫu tạo phôi và số phôi/mẫu nhiều nhất ở môi trường nuôi cấy SH có 5 mg/L NAA. Đây là nghiên cứu đầu tiên thực hiện thành công tạo phôi vô tính trực tiếp từ mảnh lá NGBCC.
Thí nghiệm này, 2,4-D cũng đã được bố trí thực hiện trên NGBCC nhưng với kết quả âm tính trong tạo phôi, chỉ ghi nhận được hiện tượng hình thành mô sẹo.
Theo một số tác giả, kiểu gen thực vật [109], loại môi trường khoáng cơ bản
[110], một số thành phần khoáng đơn lẻ [111], công thức môi trường nuôi cấy bao gồm chất ĐHST,..[112][70] có ảnh hưởng quan trọng đến sự hình thành phôi vô tính trực tiếp/gián tiếp.
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của NAA và môi trường khoáng đến sự tạo phôi vô tính trực tiếp từ mô lá ở 60 NSC. NAA (mg/L) 0 1 2 3 4 5 6 0 1 2 3 4 5 6 0 1 2 3 4 5 6 0 1 2 3 4 5 6
*Các chữ cái khác nhau trong một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức p ≤ 0,05 trong phép thử Duncan. Số liệu (%) được chuyển đổi sang dạng arcsin √
khi phân tích thống kê.
Hình 3.2. Mảnh lá tạo phôi ở môi trường ½MS, MS, B5, SH có NAA, 60 NSC.
A,B,C,D. Môi trường ½MS, MS, B5, SH có 3 mg/L NAA; E,F,G,H. Môi trường
½MS, MS, B5, SH có 4 mg/L NAA; I,J,K,L. Môi trường ½MS, MS, B5, SH có 5 mg/L NAA; thanh ngang 10 mm.
Khác với cảm ứng tạo phôi trực tiếp, quá trình tạo phôi gián tiếp có thể gây ra biến dị dòng soma ở chuỗi DNA do trải qua giai đoạn mô sẹo [113]. Do vậy, theo chúng tôi tạo phôi trực tiếp rất có ý nghĩa trong nhân giống cây trồng – nghiên cứu dựa trên nguyên tắc đồng nhất về mặt di truyền.
Quan sát cấu trúc giải phẫu phôi
Khảo sát cấu trúc giải phẫu phôi bằng phương pháp nhuộm hai màu đối với 03 thể phôi (cầu, trái tim, thủy lôi) đã được thực hiện. Quan sát dưới kính hiển vi, đã ghi nhận được lớp tế bào biểu bì (epidermis) đặc trưng ở cả 03 dạng phôi, và sự hiện diện của mạch dẫn ở cấu trúc phôi dạng thủy lôi (Hình 3.3).
Hình 3.3. Các giai đoạn phát triển của phôi vô tính và hình thái giải phẫu phôi tương ứng.
A,B,C. Dạng phôi cầu, phôi tim, phôi thủy lôi; D,E,F. Hình thái giải phẫu tương ứng dạng phôi cầu, phôi tim, phôi thủy lôi, (LM: Lá mầm, BB: Biểu bì, M: Mạch; thanh ngang 1 mm).