5. Tính mới của đề tài
3.2.3. Quan sát cấu trúc giải phẫu phôi sơ cấp và phôi thứ cấp
Khảo sát hình thái giải phẫu mô tế bào phôi bắt đầu có lá mầm phát sinh từ thân (trụ dưới lá mầm) phôi sơ cấp nuôi cấy trên môi trường đặc (Hình 3.30A), phôi cầu tạo từ thân phôi sơ cấp nuôi cấy trong môi trường lỏng (Hình 3.30D), phôi cầu hình thành từ lá mầm (Hình 3.30H) và rễ phôi sơ cấp (Hình 3.30J) đã được thực hiện. Từ kết quả thu được, theo chúng tôi, phôi thứ cấp phát sinh từ sự phân chia của một/vài/nhiều tế bào/lớp tế bào bên ngoài thuộc vùng vỏ (cortex) của thân phôi sơ cấp (Hình 3.30B,C,E,F), cũng không ghi nhận được sự thay đổi nhiều của mô tế bào
ở gần/vị trí mạch dẫn. Tương tự, phôi thứ cấp phát sinh từ lá mầm có nguồn gốc từ lớp biểu mô của lá mầm phôi sơ cấp (Hình 3.30I) và phôi thứ cấp từ rễ có nguồn gốc từ biểu mô vùng vỏ rễ phôi sơ cấp (Hình 3.30K).
Hình 3.30. Hình thái giải phẫu của phôi sơ cấp và thứ cấp.
A,B,C. Phôi thứ cấp hình thành trên thân phôi sơ cấp ở môi trường đặc, hình thái giải phẫu tương ứng. D,E,F. Phôi thứ cấp hình thành trên thân phôi sơ cấp ở môi trường lỏng, hình thái giải phẫu tương ứng. G,H,I. Phôi thứ cấp hình thành từ lá mầm phôi sơ cấp ở mặt dưới, mặt trên, hình thái giải phẫu tương ứng, (vạch đen chỉ vị trí cắt thu lát mỏng tế bào); J,K. Phôi thứ cấp hình thành ở phần rễ phôi sơ cấp, hình thái giải phẫu tương ứng, hình vuông chỉ vị trí vùng rễ khảo sát; mũi tên đen/trắng chỉ vị trí phôi thứ cấp; M: mạch dẫn ở thân phôi, ở lá mầm và rễ phôi; hình chụp dưới kính hiển vi soi nổi với độ phóng đại 20X)
Sukhada và cộng sự (2010) đã sử dụng kỹ thuật hóa mô để khảo sát sự hình thành phôi thứ cấp từ phôi sơ cấp chuối (cv. Nanjangud Rasbale) (tái sinh từ mô sẹo có khả năng sinh phôi từ hoa đực non nuôi cấy trên môi trường MS có 18,10 μM 2,4-D, 5,37 μM NAA và 5,71 μM IAA) với kết quả đã ghi nhận được phôi thứ cấp hình thành trực tiếp từ lớp biểu bì (epidermis) của phôi sơ cấp, không qua trung gian giai đoạn mô sẹo theo hai cách, một là, phôi thứ cấp có nguồn gốc từ tế bào đơn biểu mô
của phôi cầu sơ cấp non; hai là, phôi thứ cấp có nguồn gốc từ nhiều tế bào biểu mô lá mầm của phôi sơ cấp trưởng thành [171]. Trong nghiên cứu tạo phôi NGBCC, đã ghi nhận được sự hình thành phôi cầu thứ cấp cấp 2 (tertiary) ở mặt dưới của lá (Hình 3.30G, vị trí mũi tên trắng) từ phôi cầu thứ cấp cấp 1; theo chúng tôi, phôi này cũng có thể có nguồn gốc từ tế bào biểu mô phôi cầu tương tự kết luận của các tác giả vừa nêu trên.
Phôi thứ cấp Arabidopsis thaliana (L.) Heynh hình thành trực tiếp từ lớp tế bào bề mặt và dưới bề mặt, mặt trên lá mầm phôi hợp tử non nuôi cấy trên môi trường B5 có 5 µM 2,4-D [172]; tương tự, ở Dendrobium cv. Chiengmai Pink, phôi thứ cấp phát sinh từ các lớp tế bào biểu bì mặt trên, ở vị trí đầu lá và gần vị trí cắt của đoạn lá mầm phôi sơ cấp (1 tháng tuổi, nuôi cấy trên môi trường ½MS có 1 mg/L TDZ) [91]. Và ở Pistacia vera, phôi hình thành có nguồn gốc tế bào biểu mô hoặc dưới biểu mô của lá [173].
Cũng qua khảo sát mô tế bào, Wang và cộng sự (2014) cho rằng ngoài tái sinh phôi theo cách thông qua mô sẹo, các tiền phôi đa bào (multicellular proembryos) cũng được hình thành trực tiếp từ lớp tế bào bề mặt (surface layer) của phôi non Tapiscia sinensis qua nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 1 mg/L 2,4- D, 0,5%than hoạt tính [94].
Xu và cộng sự (2019) đã ghi nhận được sự hình thành trực tiếp phôi thứ cấp
Ranunculus sceleratus từ bề mặt các loại mẫu cấy nh mảnh lá (1 – 1,5 cm2), đoạn thân và đoạn rễ (1 - 2 cm) của cây mầm (2 tuần tuổi, cao 4 – 5 cm, có nguồn gốc phôi hợp tử) nuôi cấy trên môi trường MS có nồng độ NAA cao (10 mg/L) [170]. Phôi thứ cấp hình thành trực tiếp từ đoạn rễ (~ 8 mm) cây mầm (7 ngày tuổi, từ phôi hợp tử Brassica oleracea L. var. Italica) nuôi cấy trong môi trường MS có 1 mg/L 2,4-D, tuy nhiên phôi thứ cấp lại có nguồn gốc từ các lớp tế bào trụ bì (pericycle cell layers) gần hệ mạch [169]. Ở Quercus robur L., Zegzouti và cộng sự (2001) đã ghi nhận được hai kiểu sinh phôi thứ cấp khác nhau từ vật liệu nuôi cấy là thân và rễ phôi sơ cấp (đã bỏ lá mầm):
một là, sinh phôi gián tiếp, ở trường hợp này có sự phân chia tế bào ở mô vùng vỏ dẫn đến sự hình thành mô sẹo, sau đó tạo các khối phôi thứ cấp tròn từ vùng mô có khả năng phân bào mạnh ở mặt ngoài) mô sẹo; hai là, sinh phôi trực tiếp, có hai trường hợp xảy ra: (1) sự phân chia tế bào biểu bì trên diện rộng, và
(2) sự phân chia của một số tế bào biểu bì (3 – 4 tế bào) dẫn đến kết quả tạo phôi thứ cấp [76].
Như vậy, sự sinh phôi thứ cấp từ thân, lá và rễ phôi sơ cấp ở NGBCC cũng theo hướng chung của sự sinh phôi thứ cấp nói chung ở thực vật/cây trồng – tương tự như kết quả của một số tác giả nêu trên.