5. Tính mới của đề tài
3.2.2.3. Ảnh hưởng của kích thước phôi đến sự tạo phôi thứ cấp
Sau 30 ngày nuôi cấy, kết quả (Bảng 3.11) cho thấy, trong 03 loại kích thước phôi, với phôi có kích thước trung bình (~ 10 mm) tạo số phôi thứ cấp cao nhất (17,84) ở 30 NSC; ở phôi nhỏ và phôi to có số phôi thứ cấp là 7,51 và 13,92. Quan sát về hình thái của phôi thứ cấp nhận thấy phôi cấy ban đầu có kích thước nhỏ (~ 7 mm, Hình 3.25A), hầu như tạo phôi có dạng cầu (Hình 3.25B,C,D,E), còn phôi cấy TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com
có kích thước trung bình (~ 10 mm, Hình 3.25F) phôi hình thành rất đa dạng, từ dạng cầu đến dạng có lá mầm (Hình 3.25G,H,I), với phôi cấy có kích thước lớn (~ 15 mm, Hình 3.25J) phôi hình thành có dạng có lá mầm (Hình 3.25K,L,M). Điều đó chứng tỏ, sự khác nhau về kích thước phôi cấy ban đầu có ảnh hưởng đến số phôi thứ cấp hình thành và sự phát sinh hình thái phôi thứ cấp. Như vậy, ở NGBCC vật liệu sử dụng có kích thước trung bình (bước đầu có lá mầm) là thích hợp cho nhân phôi.
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của kích thước phôi đến sự tạo phôi thứ cấp, trong môi trường lỏng SH, 30 NSC. Kích thước phôi (mm) ~ 7 ~ 10 ~ 15
*Các chữ cái khác nhau trong một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức p ≤ 0,05 trong phép thử LSD.
Ảnh hưởng của kích thước phôi đến sự tạo phôi thứ cấp đã được nghiên cứu trên một số đối tượng cây trồng. Phôi hợp tử Brassica oleracea (var. gongylodes) ở giai đoạn mới có lá mầm là vật liệu nuôi cấy cho tỷ lệ tạo phôi thứ cấp cao (80,7%) khi được nuôi cấy trên môi trường không có chất điều hòa sinh trưởng [159]. Phôi vô tính giai đoạn thủy lôi của dòng cà phê Arabica Arabica (AS2K) tạo phôi thứ cấp tốt trên môi trường MS (đặc và bán rắn) có bổ sung Thidiazuron ở nồng độ 9,08 μM
[160]. Corredoira và cộng sự (2015) sử dụng phôi vô tính giai đoạn có lá mầm và cụm phôi cầu và thủy lôi Eucalyptus globulus và E. saligna × E. maidenii nuôi cấy trên môi trường có 16,11 µM NAA nhằm phát triển sinh khối [161]. Tuy nhiên, đối với Malus x domestica Borkh. (cv. 'Gloster 69'), phôi vô tính kích thước to lại cho tỷ lệ tạo phôi thứ cấp cao (> 73%) khi được nuôi cấy trên môi trường có tổ hợp NAA/BAP/KIN hoặc chỉ có TDZ (10 μM) [162].
Hình 3.25. Ảnh hưởng của kích thước phôi đến sự tạo phôi thứ cấp trong môi trường lỏng SH, 30 NSC.
A. Phôi kích thước nhỏ dùng nuôi cấy; phôi thứ cấp hình thành trên thân phôi (B,C), rễ (D), lá (E) (vị trí mũi tên). F. Phôi kích thước trung bình dùng nuôi cấy; phôi thứ cấp hình thành trên thân phôi (G), rễ (H), lá (I). J. Phôi kích thước to dùng nuôi cấy; phôi thứ cấp hình thành trên thân phôi (K), rễ (L), lá (M).
3.2.2.4. Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tăng trưởng sinh khối phôi
Ở 30 NSC, kết quả (Bảng 3.12) cho thấy, KLT phôi đạt giá trị cao nhất (4,67 g) và hệ số nhân phôi cũng đạt cao nhất 15,57 ở môi trường nuôi cấy SH có bổ sung 50 g/L sucrose. Nghiệm thức có nồng độ sucrose thấp (20 g/L) KLT phôi thu nhận được là thấp nhất (2,14 g) phôi có màu xanh, lá mầm to, rễ dài so với phôi trong môi trường có nồng độ sucrose cao (40 – 50 g/L) - phôi màu hơi vàng, lá mầm nhỏ, và rễ ngắn (Hình 3.26).
Bảng 3.12. Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tăng trưởng sinh khối phôi trong môi trường lỏng SH, 30 NSC. Nồng độ sucrose (g/L) 20 30 40 50
*Các chữ cái khác nhau trong một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức p ≤ 0,05 trong phép thử LSD.
Hình 3.26. Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tăng sinh khối phôi, trong môi trường lỏng SH, 30 NSC.
A,B,C,D. Sự phát sinh phôi thứ cấp trong môi trường có nồng độ sucrose 20, 30, 40, 50 g/L
Naing và cộng sự (2013) kết luận cảm ứng tạo phôi thứ cấp Chrysanthemum cv. Euro tốt hơn trên môi trường (MS có 2 mg/L 2,4-D, 2 mg/L kinetin) có 60 g/L đường so với 30 g/L [75]. Ngược lại, phôi thứ cấp Panax ginseng phát sinh trên môi trường MS, không có chất điều hòa sinh trưởng, với nồng độ đường tương đối thấp (20 - 30 g/L); và nồng độ 20 g/L kích thích sự phát triển tiếp tục của phôi nhưng nồng độ 30 g/L gây hạn chế dù kích thích tăng sinh khối [73]. Tương tự, Al Shamari và cộng sự (2018) kết luận phôi thứ cấp Brassica oleraceae var. Botrytis phát sinh tốt từ trụ dưới lá mầm phôi sơ cấp cũng trên môi trường bán rắn MS (không bổ sung chất
điều hòa sinh trưởng) có 30 g/L đường [163]. Nhìn chung, sự phát triển sinh khối phôi NGBCC có nhu cầu về đường khá cao – tương tự một số trường hợp nêu trên.
3.2.2.5. Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng đến sự tăng trưởng sinh khối phôi
Kết quả cho thấy (Bảng 3.13, Hình 3.27), cường độ ánh sáng 2.000 - 4.000 lux đã có ảnh hưởng tích cực đến sự tăng trưởng sinh khối phôi so với nuôi phôi trong điều kiện tối. Hệ số nhân phôi ở nghiệm thức tối, 2.000 lux và 4,000 lux lần lượt là 8,42; 9,37 và 10,40. Nói chung, phôi nuôi ngoài sáng xanh hơn phôi nuôi trong tối. Phôi là cấu trúc mang nhiều lục lạp nên thường được nuôi cấy trong điều kiện có chiếu sáng. Naing và cộng sự (2013) đã thực hiện nuôi cấy phôi sơ cấp
Chrysanthemum cv. Euro (môi trường MS có 2 mg/L 2,4-D và 2 mg/L kinetin) nhằm tạo phôi thứ cấp ở điều kiện chiếu sáng cao 60 - 100 µmol m-2 s-1 (~ 4.500 – 7.500 lux) (16 h sáng : 8 h tối) [75]. Sử dụng cường độ ánh sáng 80 µmol m-2 s-1 (~ 6.000 lux), 40 µmol m-2 s-1 (~ 3.000 lux) đối với nuôi cấy tạo phôi thứ cấp Brassica oleracea var. Botrytis [163], Polyscias filicifolia[54], theo thứ tự, cũng đã được ghi nhận. Ngược lại, ở tạo phôi thứ cấp Quercus robur, nuôi cấy được thực hiện trong cùng điều kiện tối [76] như nuôi cấy vật liệu phôi sơ cấp. Ở NGBCC, nuôi nhân phôi ở điều kiện ánh sáng cao đã thúc đẩy sự hình thành phôi thứ cấp dẫn đến tăng sinh khối tốt – phù hợp với tình hình chung về bố trí điều kiện sáng khi dùng vật liệu chứa nhiều lục lạp.
Bảng 3.13. Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng đến sự tăng trưởng sinh khối phôi, trong môi trường lỏng SH, 30 NSC.
Cường độ ánh sáng (lux) 0 (tối) 2.000 4.000
*Các chữ cái khác nhau trong một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức p ≤ 0,05 trong phép thử LSD.
Hình 3.27. Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng đến sự tăng trưởng sinh khối phôi, trong môi trường lỏng SH, 30 NSC
A. Phôi nuôi trong tối (ĐC); B,C. Phôi nuôi ngoài sáng cường độ 2.000 lux, 4.000 lux; D,E. Cận cảnh phôi nuôi trong tối, ánh sáng 4.000 lux.