5. Tính mới của đề tài
1.3.2. Một số nghiên cứu về sự phát sinh phôi vô tính
Nói chung, sự phát sinh phôi vô tính (ở các giai đoạn nêu trên) đều chịu ảnh hưởng bởi một số yếu tố như kiểu gen thực vật, tuổi sinh lý và loại mẫu nuôi cấy, thành phần môi trường khoáng, chất ĐHST, đường, cường độ ánh sáng,.. Ở
Arabidopsis, khá nhiều loại, kích thước mẫu với tuổi sinh lý khác nhau đã được sử dụng để tạo phôi vô tính như phôi hợp tử trưởng thành và phôi non, chồi, nụ hoa. Ở
Sapindus mukorosi, lá 6 ngày tuổi là thích hợp cho cảm ứng tạo phôi. Ở Eucalyptus camaldulensis, lá mầm 10 ngày tuổi cho tỷ lệ tạo mô sẹo sinh phôi cao nhất [70].
Ở nghiên cứu của Kharwanlang và cộng sự (2016a), kết quả cho thấy môi
trường khoáng MS có 5 mg/L 2,4-D thích hợp cho nuôi cấy tạo mô sẹo và mô sẹo có khả năng sinh phôi (từ vật liệu LMTB thân rễ) Panax pseudoginseng so với môi trường SH [71]. Trong 3 loại môi trường sử dụng (MS, B5, và SH) để nghiên cứu tạo
phôi vô tính Panax ginseng trực tiếp từ mảnh lá mầm phôi hợp tử, kết quả cho thấy môi trường MS (tỷ lệ NH4+:NO3-
là 21:39) là thích hợp nhất (MS có 50 g/L đường, 1% agar) [72].
Đường là yếu tố cung cấp năng lượng cho hoạt động sống của các thể nuôi cấy mô trong đó có phôi vô tính, nồng độ sử dụng phù hợp với nhu cầu của từng loại mô nuôi cấy, dao động từ 20 - 50 g/L. Kim và cộng sự (2012) đã sử dụng 20 - 30 g/L đường cho nuôi cấy phôi thứ cấp Panax ginseng, tùy giai đoạn [73]. Nồng độ đường
50 g/L là thích hợp cho tạo phôi vô tính từ mô sẹo có nguồn gốc từ LMTB cắt ngang thân rễ Panax vietnamensis[74].
Ánh sáng cũng là yếu tố được quan tâm nghiên cứu đặc biệt đối với thể phôi vô tính đang trong quá trình chuyển giai đoạn phát triển hay trong quá trình nhân sinh khối. Thông thường, sử dụng cường độ ánh sáng 4.000 lux để nuôi cấy. Nuôi cấy phôi vô tính sơ cấp Chrysanthemum nhằm tạo phôi thứ cấp được thực hiện ở điều kiện chiếu sáng cường độ cao ~ 4.500 - 7.500 lux (16 h sáng : 8 h tối) [75]. Sử dụng cường độ ánh sáng ~ 3.000 lux đối với nuôi cấy tạo phôi thứ cấp Polyscias filicifolia [5454]. Tuy nhiên, ở tạo phôi thứ cấp Quercus robur, nuôi cấy được thực hiện trong điều kiện tối như nuôi cấy vật liệu phôi sơ cấp [76].
Nước dừa (10 - 20% - v/v) cũng được sử dụng trong nghiên cứu liên quan đến phôi vô tính, vì chứa nhiều chất dinh dưỡng (đường, muối khoáng, acid amin) và chất ĐHST tự nhiên. Khierallah và Hussein (2013) đã nghiên cứu ảnh hưởng của nước dừa (% - v/v) với nhiều nồng độ khác nhau trên sự tạo mô sẹo và tái sinh phôi vô tính
Phoenix dactylifera từ nuôi cấy chồi đỉnh. Kết quả cho thấy tỷ lệ nước dừa 20% là tốt nhất cho tạo mô sẹo (chỉ tiêu khối lượng tươi) và tái sinh phôi vô tính (chỉ tiêu số phôi) [77]. Tương tự, Tô Thị Nhã Trầm và cộng sự (2020) cũng đã sử dụng nước dừa trong tạo mô sẹo và tạo phôi đinh lăng lá xẻ nhỏ (Polyscias fruticosa). Kết quả cho thấy mô sẹo cho tỷ lệ (%) phát sinh phôi vô tính tối ưu trên môi trường MS bổ sung
100 mL/L nước dừa kết hợp với 0,5 mg/L BA sau 6 tuần nuôi cấy. Phôi phát sinh từ
nuôi cấy mô sẹo mẫu lá trên môi trường MS có bổ sung 0,1 mg/L kinetin kết hợp với
150 mL/L nước dừa cho tỷ lệ tái sinh chồi (%) và số chồi/mẫu cao hơn các nghiệm thức khác sau 8 tuần nuôi cấy. Ngoài ra, cây in vitro được nuôi cấy trên môi trường có bổ sung 30 g/L đường và 100 mL/L nước dừa cho số rễ/cây cao nhất [78].
Chất ĐHST là yếu tố mang tính quyết định đến sự hình thành và phát triển phôi vô tính tái sinh trực tiếp (từ mảnh lá, mảnh lá mầm,..) và gián tiếp (từ mô sẹo hoặc cụm tế bào huyền phù có khả năng sinh phôi). Auxin (IAA, NAA, IBA, 2,4- D,..) và cytokinin (BA, kinetin, TDZ), ngoài tác động ở dạng riêng lẻ, việc kết hợp chúng cũng có tác động trong kích thích tạo phôi. Việc sử dụng 2,4-D là rất cần thiết trong khởi tạo phôi vô tính và giúp phôi phát triển ở giai đoạn đầu [79]. Ví dụ sản lượng cụm tế bào có khả năng sinh phôi chà là tăng 20 lần nhờ bổ sung 2,4-D nồng độ thấp vào môi trường nuôi cấy [80]. Auxin làm thay đổi biến dưỡng nội sinh theo cách tích cực, ví dụ ở cà rốt, sử dụng 2,4-D làm tăng khả năng đáp ứng sinh phôi qua làm tăng hàm lượng IAA nội sinh; 2,4-D tạo điều hòa và cân bằng lượng auxin nội sinh [81]. Tiền xử lý thực vật với auxin trước khi thực hiện cảm ứng tạo phôi ở
C. canephora cũng đã làm thay đổi biến dưỡng IAA nội sinh; và trong quá trình cảm ứng tạo phôi C. canephora có sự gia tăng hàm lượng IAA nội sinh và sự biểu hiện của gen mã hóa enzyme tryptophan aminotransferase (tryptophan aminotransferase of Arabidopsis 1; CcTAA1) và enzyme flavin mono-oxygenase (YUCCA; CcYUC1 và CcYUC3). Cả hai enzyme này tạo sinh tổng hợp IAA (Ayil- Gutiérrez và cộng sự, 2013). NAA (2 mg/L) thích hợp cho nuôi cấy tạo phôi trực tiếp từ mảnh lá sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis) [38]. Chất ĐHST khác, như cytokinin cũng tham gia vào sự phát triển của thực vật, kích thích sự hình thành nụ, làm chậm sự lão hóa lá và cùng với auxin kích thích sự phân bào; cả hai auxin và cytokinin có tác động cộng hưởng [82]. Tỷ lệ cao giữa cytokinin và auxin kích thích sự tạo chồi; ngược lại, tỷ lệ này thấp cảm ứng tạo rễ và sự hình thành mô phân sinh hoàn chỉnh ở Pisum sativum. Hai chất ĐHST này hoặc có tác động cộng hưởng hoặc đối kháng trong suốt quá trình tạo phôi [83]. Ở C. canephora, sự di chuyển phân cực của IAA là cần thiết cho sự hình thành trục ngọn-gốc [84]. Cytokinin cũng cần thiết để duy trì mức sinh tổng hợp auxin cơ bản trong quá trình phát triển rễ và chồi, do vậy, có thể có một hệ thống điều hòa thống nhất nhằm tạo hàm lượng thích hợp giữa auxin và sự phát triển của thực vật [85].
Quá trình hình thành phôi vô tính có sự tích hợp của các tín hiệu nội sinh và sự tái lập trình gen nhằm giải phóng tín hiệu khởi tạo quá trình phát sinh phôi. Các auxin ngoại sinh, ở dạng riêng lẻ hoặc kết hợp với các chất ĐHST khác hoặc stress, cảm ứng sự biểu hiện của các gen khác dẫn đến sự thay đổi chương trình di truyền
của tế bào soma và điều hòa quá trình dịch chuyển qua từng giai đoạn phát triển của phôi [86]. Hầu hết các gen trên thuộc về một trong 4 nhóm: các yếu tố phiên mã (transcription factors - TFs), các protein tác động ở chu kỳ tế bào, sinh tổng hợp chất ĐHST, chủ yếu là auxin, cũng như các protein tham gia vào con đường tín hiệu [87].
Ở cà rốt (Daucus carota), Michalczuk và cộng sự (1992) đã nghiên cứu các mức auxin nội sinh của tế bào ở các giai đoạn nuôi cấy tạo phôi khác nhau: (1) Nuôi cấy tế bào huyền phù trong môi trường MS có 1 mg/L 2,4-D; (2) Sau đó chuyển sang nuôi cấy trong môi trường không có 2,4-D nhằm tạo phôi. Kết quả cho thấy có sự thay đổi con đường sinh tổng hợp IAA trong suốt quá trình phát sinh phôi vô tính. Ở
nuôi cấy huyền phù tế bào tăng sinh trong môi trường có 2,4-D, nhận thấy IAA nội sinh hình thành đầu tiên từ cơ chất tryptophan, nhưng ở quá trình phát triển của phôi vô tính, con đường sinh tổng hợp IAA không từ tryptophan lại có vai trò nổi trội hơn đối với sinh tổng hợp IAA nội sinh. Như vậy, sự thay đổi về nồng độ auxin ngoại sinh có ảnh hưởng đến sinh tổng hợp auxin nội sinh - dẫn đến tạo phôi vô tính [88].
Ribnicky và cộng sự (1996) đã nghiên cứu ảnh hưởng của auxin ngoại sinh ở dạng tự do và phức hợp đến biến dưỡng auxin ở nuôi cấy đoạn trụ dưới lá mầm (1 - 2 cm, của cây 7 ngày tuổi từ hạt Daucus carota L. cv Danvers) trên môi trường MS có hoặc không có auxin 2,4-D, [2H4]IAA, NAA (10 mM) và có 250 mM [2H5]L- tryptophan. Kết quả cho thấy 2,4-D kích thích sự hình thành và tăng sinh mô sẹo, 2,4-
D tích lũy ở dạng tự do với lượng lớn và tác động không nhiều lên nồng độ IAA nội sinh. NAA kích thích sự hình thành và tăng sinh mô sẹo dẫn đến mô ở trạng thái có thể phát sinh cơ quan – chồi và rễ. NAA được phát hiện chủ yếu ở dạng phức hợp và
cũng có tác động không nhiều lên nồng độ IAA nội sinh. Như vậy, 2,4-D và NAA đã có tác động trực tiếp lên mô cấy dẫn đến sự hình thành các loại mô tế bào khác nhau, không do sự thay đổi hàm lượng IAA nội sinh. Không ghi nhận được ảnh hưởng của [2H4]IAA lên mô cấy có thể do [2H4]IAA bị biến đổi nhanh chóng sang dạng bất hoạt hoặc có thể [2H4]IAA làm giảm nồng độ IAA nội sinh theo cơ chế phản hồi. Sự hiện diện của auxin ngoại sinh đã không gây ảnh hưởng đến tryptophan nội sinh hoặc nguồn (pool) IAA. Như vậy, auxin ngoại sinh không làm thay đổi con đường sinh tổng hợp IAA nhưng cần thiết cho cảm ứng sự hình thành và tăng sinh mô sẹo cũng như cảm ứng hình thành tế bào có khả năng sinh phôi [89].
Ayil-Gutiérrez và cộng sự (2013) cho rằng hầu hết quá trình phát sinh phôi vô tính đòi hỏi sự hiện diện của ít nhất của một loại auxin ngoại sinh, hoặc hiện diện trước đó hoặc hiện diện trong suốt quá trình phát sinh phôi; ngoài ra, còn kể đến vai trò của auxin nội sinh. Auxin ngoại sinh cảm ứng sự hình thành auxin nội sinh – cũng cần thiết cho sự phát sinh phôi. Các tác giả trên đã nghiên cứu động học của nồng độ IAA và một số phức hợp của IAA (IAA-Ala, IAA-Glu) trong suốt thời kỳ cảm ứng phát sinh phôi vô tính ở cà phê (Coffea canephora) qua nuôi cấy các mảnh lá (0,25 cm2, dùng môi trường lỏng lắc có 5 µM BA) của cây có nguồn gốc phôi vô tính (40 tuần tuổi, có 6 cặp lá, được tiền nuôi cấy trong môi trường MS có 0,54 µM NAA và 2,32 µM kinetin trong 14 ngày). Trong suốt thời gian tiền nuôi cấy cây trong môi trường nuôi cấy có auxin NAA nói trên, nhận thấy có sự gia tăng mạnh của cả IAA ở dạng tự do, IAA ở dạng phức hợp và IBA. Sự gia tăng này đi kèm với sự gia tăng biểu hiện của các gen có liên quan. Sự cân bằng giữa IAA tự do và IAA ở dạng phức hợp là rất cần thiết cho sự biểu hiện của các gen liên quan đến quá trình tạo phôi. Như vậy, ở nghiên cứu này, quá trình phát sinh phôi vô tính bao gồm 2 pha cơ bản: Pha 1 cần có auxin NAA và kinetin (2 tuần), pha 2 chỉ cần có sự hiện diện của BA [90].
Nghiên cứu của Verma và cộng sự (2018) đã cho thấy vai trò của auxin và sự di chuyển phân cực của auxin đã ảnh hưởng đến sự tạo phôi Digitalis trojana qua nuôi cấy các đoạn trụ dưới lá mầm (5 mm) phôi hợp tử trên môi trường MS có IAA (0,1 - 1 mg/l), TIBA (chất ức chế sự di chuyển auxin) (0,1 - 1 mg/l), IAA và TIBA. Kết quả cho thấy ở nghiệm thức chỉ có IAA (0,5 mg/L), tỷ lệ tạo phôi cao nhất - 52%, số phôi 10 phôi/mẫu; ngược lại, ở NT có 0,5 mg/L IAA, 1 mg/L TIBA, tỷ lệ tạo phôi chỉ đạt 24%; 3,6 phôi/mẫu, và có nhiều phôi bất thường. TIBA đã gây đáp ứng chậm đối với tạo phôi và tái sinh nhiều phôi bất thường. Như vậy, auxin và sự di chuyển phân cực của auxin có vai trò quan trọng đối với tạo phôi vô tính ở
Digitalis trojana[14].
Gaoyin và cộng sự (2020) đã nghiên cứu sự thay đổi các đặc tính hóa sinh trong quá trình phát sinh phôi vô tính ở Ormosia henryi Prain qua nuôi cấy phôi hợp tử trưởng thành trên các môi trường theo thứ tự: (1) Môi trường tạo mô sẹo: B5 có 2 mg/L 2,4-D (auxin mạnh), 0,2 mg/L BA, 30 g/L đường, 500 mg/L glutamine, thời gian nuôi 6 tuần; (2) Môi trường tăng sinh mô sẹo đồng thời thu nhận mô sẹo có khả năng sinh phôi: B5 có 1 mg/L 2,4-D (giảm nồng độ), 0,5 mg/L kinetin, thời gian nuôi
4 tuần; (3) Môi trường nuôi mô sẹo có khả năng sinh phôi nhằm tạo phôi cầu: như trên, nuôi 2 tuần trong tối ở 25 ± 2oC; (4) Môi trường nuôi phôi cầu tạo phôi có lá mầm: B5 có 0,2 mg/L NAA (auxin yếu), 0,5 mg/L thidiazuron, thời gian nuôi 60 ngày. Kết quả nghiên cứu cho thấy: (1) Các hợp chất cung cấp năng lượng: Hàm lượng đường hòa tan và tinh bột giảm dần trong suốt quá trình sinh phôi do nhu cầu tiêu thụ lượng lớn các hợp chất này; ngược lại, hàm lượng protein lại tăng lên. Ở mô sẹo có khả năng sinh phôi, sự tích lũy đường hòa tan, tinh bột và protein cao – cơ sở quan trọng về năng lượng cho quá trình tạo phôi so với mô sẹo không có khả năng sinh phôi; (2) chất ĐHST nội sinh: Ở các giai đoạn phát triển khác nhau của phôi, hàm lượng IAA tăng có ý nghĩa ở giai đoạn phôi có lá mầm – có liên quan đến sự hình thành cực phôi. Tương tự, hàm lượng cytokinin cũng tăng ở phôi giai đoạn này
– có liên quan đến sự trưởng thành và nẩy mầm của phôi. IAA cũng cao ở mô sẹo có khả năng sinh phôi so với mô sẹo không có khả năng sinh phôi; (3) Về tỷ lệ giữa các chất ĐHST nội sinh: Tương tác giữa các chất ĐHST nội sinh ở các giai đoạn phát triển khác nhau của quá trình phát sinh phôi vô tính có thể được thể hiện qua tỷ lệ
giữa chúng và được xem như chỉ số sinh lý để tìm hiểu sự phản biệt hóa và tái biệt hóa của tế bào. Tỷ lệ IAA/ABA, IAA/GAs, AUX/GAs và AUX/ABA giảm dần, tỷ lệ IAA/CKs, AUX/CKs, ABA/CKs and GAs/CKs lúc đầu tăng và sau đó giảm. Tỷ lệ IAA/CKs và AUX/CKs thấp nhất ở phôi có lá mầm [12].
Huyền phù tế bào đơn của dòng Medicago falcata 47/1/150 có khả năng sinh phôi cao đã được thực hiện. Huyền phù tế bào này bao gồm nhiều loại tế bào đơn khác nhau. Hầu hết các tế bào đều có khả năng tạo phôi sau quá trình phân chia không đối xứng. Nhằm khảo sát rõ quá trình phân chia này, huyền phù tế bào mang gen gusA (mã hóa enzyme β-glucoronidase) cũng đã được thực hiện và nuôi cấy theo hướng phân bào tạo phôi trực tiếp. Từ đó, các bước phát triển của phôi đã được khảo sát chi tiết bắt đầu từ sự phân chia không đối xứng – tín hiệu đầu tiên của quá trình hình thành phôi vô tính [67].
Quy trình tạo phôi trực tiếp, tạo phôi thứ cấp và tái sinh cây từ phôi ở
Dendrobium cv. Chiengmai Pink đã được thực hiện. Kết quả cho thấy phôi tái sinh tốt nhất trên môi trường có bổ sung 1 mg/L TDZ. Phôi tái sinh trực tiếp nhiều ở vị trí gần vết cắt mẫu và ít hơn ở vị trí đầu lá. Quá trình cấy chuyền cho thấy có hiện tượng
tạo phôi thứ cấp trực tiếp từ phôi sơ cấp. Khảo sát hình thái giải phẫu cho thấy phôi thứ cấp hình thành từ lớp tế bào bên ngoài của phôi sơ cấp [91].
Gow và cộng sự (2009) đã ghi nhận được phôi vô tính Phalaenopsis amabilis
Shimadzu var. formosa và Phalaenopsis ‘Nebula’ tái sinh tái sinh trực tiếp từ mảnh lá (1-2 cm, cấy úp) trên môi trường ½MS có bổ sung 3 mg/L TDZ hoặc 3 mg/L BA. Qua quan sát dưới kính hiển vi điện tử quét, nhận thấy phôi vô tính với nhiều dạng khác nhau hình thành trực tiếp từ lớp tế bào bề mặt của mảnh lá ở cả 2 giống [92].
Phôi Curcuma amada Roxb. hình thành trực tiếp qua nuôi cấy 2 giai đoạn (1) Nuôi cấy 2 tuần trên môi trường có bổ sung 2,24 μM và 1,11 μM BA, sau đó (2) Nuôi cấy tiếp tục trên môi trường có 9,10 μM TDZ và 1,33 μM NAA. Qua khảo sát hóa mô tế bào và quan sát dưới kính hiển vi điện tử, kết quả cho thấy phôi có nguồn gốc từ quá trình phân chia tế bào ở biểu mô và tế bào dưới biểu mô [93].
Cũng qua khảo sát mô tế bào, Wang và cộng sự (2014) cho rằng ngoài tái